微囊化轉(zhuǎn)NGF基因成纖維細(xì)胞治療周圍神經(jīng)損傷的研究.pdf

1、人們對(duì)于周圍神經(jīng)損傷和治療的研究多年來(lái)從未間斷過(guò),研究方法也在不斷進(jìn)步和深入.2001年,該科胡昭華與中科院大連化學(xué)物理研究所合作,首先開展了大鼠微囊化神經(jīng)組織/細(xì)胞移植促進(jìn)神經(jīng)再生的研究,取得了較為肯定的結(jié)果.該實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上,研究微囊化轉(zhuǎn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)基因的成纖維細(xì)胞移植后的存活、NGF分泌及其對(duì)周圍神經(jīng)再生的作用,進(jìn)一步探索治療外周神經(jīng)損傷的有效方法.研究?jī)?nèi)容和方法:(1).在克隆出小鼠β NGF的成熟cDNA序列及其前導(dǎo)

2、序列的基礎(chǔ)上,采用IL-2信號(hào)肽編碼序列連入其前導(dǎo)肽序列,構(gòu)建出分泌型NGF的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+/NGF;(2).利用FuGENE<'TM>6轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.1+/NGF導(dǎo)入NIH 3T3細(xì)胞中,用Western Blot、免疫組化檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后NGF蛋白的表達(dá)情況,并通過(guò)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)的作用來(lái)鑒定NGF的活性;(3).將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞包裹在海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微膠囊中

3、,體外培養(yǎng)并通過(guò)MTT及ELISA定期測(cè)定微囊化細(xì)胞的生長(zhǎng)和NGF分泌;(4).將微囊化的轉(zhuǎn)NGF基因NIH 3T3細(xì)胞移植在大鼠損傷坐骨神經(jīng)的周圍,通過(guò)美蘭染色、免疫組織化學(xué)、電鏡技術(shù)及電生理、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)檢測(cè)NGF對(duì)神經(jīng)損傷后軸突再生及功能恢復(fù)的影響.結(jié)論:在成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1+/NGF的基礎(chǔ)上,將其轉(zhuǎn)染NIH 3T3細(xì)胞并獲得穩(wěn)定表達(dá),然后將微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行在體移植,初步證實(shí):1.海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海