轉(zhuǎn)移性前列腺癌受甲基化調(diào)控基因的篩選與臨床價(jià)值研究.pdf

1、本文從以下四方面進(jìn)行了議論：
　　第一部分 轉(zhuǎn)移性前列腺癌的轉(zhuǎn)移能力差異篩選
　　目的:在前列腺癌細(xì)胞株中篩選出侵襲和轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)的細(xì)胞株，為進(jìn)一步尋找與前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物提供依據(jù)。材料與方法:體外培養(yǎng)LNCaP，22RV1，PC-3和DU145細(xì)胞株，通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，Transwell侵襲試驗(yàn)和Transwell遷移試驗(yàn)觀測(cè)細(xì)胞株之間侵襲和轉(zhuǎn)移能力的差異，并通過明膠酶譜試驗(yàn)監(jiān)測(cè)細(xì)胞MMPs的分泌情況。結(jié)果:

2、通過體外實(shí)驗(yàn)篩選，我們得到侵襲和轉(zhuǎn)移能力差異最大的兩株細(xì)胞LNCaP和PC-3。劃痕試驗(yàn)證實(shí)PC-3較LNCaP的遷移速率高7.31倍(p＜0.05)，侵襲試驗(yàn)中PC-3較LNCaP侵襲細(xì)胞數(shù)高3.38倍(p＜0.05)。兩株細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力均有明顯差異，通過進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，兩株細(xì)胞的MMPs水平差異十分顯著。結(jié)論:在體外PC-3較LNCaP具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，且分泌更多的基質(zhì)金屬蛋白酶。
　　第二部分 受甲基化調(diào)控

3、差異表達(dá)基因的高通量篩選與驗(yàn)證
　　目的:通過比較LNCaP和PC-3細(xì)胞基因組DNA甲基化與mRNA表達(dá)水平的差異，篩選受甲基化調(diào)控的基因并進(jìn)行驗(yàn)證。材料與方法:通過甲基化譜測(cè)序(MBD-seq)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系PC-3和LNCaP全基因組DNA甲基化修飾情況，并通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法（RNA-seq）檢測(cè)PC-3和LNCaP全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)。利用生物信息學(xué)的方法分析在兩種細(xì)胞中受甲基化調(diào)控的基因。結(jié)果:通過高通量測(cè)序與篩選，我們發(fā)

4、現(xiàn)了(CAV1，CAV2，MET，PPARG，COL6A1，ALDH6A1，ALDH2, SMAD3, ITGA6, ITGB8, MCCC1, CAPN2, JAK1, LAMB1)14個(gè)受甲基化調(diào)控，可能影響前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力差異的基因。并對(duì)其中7個(gè)基因的甲基化改變進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)論:通過高通量測(cè)序分析DNA甲基化譜改變與mRNA表達(dá)水平改變可以快速有效地分析出受甲基化調(diào)控的基因。
　　第三部分 候選基因COL6A1的體外功

5、能驗(yàn)證
　　目的:在功能上驗(yàn)證受甲基化調(diào)控的COL6A1基因在體外是否具有促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的作用。材料與方法:構(gòu)建表達(dá)針對(duì)COL6A1的shRNA與過表達(dá)COL6A1的載體并包裝慢病毒，改變?cè)屑?xì)胞系COL6A1的表達(dá)情況，通過侵襲和劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞系的功能改變。并對(duì)下游信號(hào)通路分析進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果:在本底表達(dá)低的細(xì)胞系LNCaP1中過表達(dá)COL6A1，遷移速率較對(duì)照組提高50％(p＜0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組提高78.1％(

6、p＜0.05)，MMP9和CXCR4的表達(dá)顯著提高。在本底表達(dá)COL6A1較高的PC-3中沉默COL6A1的表達(dá)，遷移速率較空載對(duì)照組降低59.4％(p＜0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少66.2％(p＜0.05)結(jié)論:在體外實(shí)驗(yàn)中COL6A1具有促進(jìn)PC-3和LNCaP侵襲遷移能力的作用。
　　第四部分 候選基因COL6A1的臨床價(jià)值研究
　　目的:在臨床樣本中檢測(cè)COL6A1是否對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移具有預(yù)測(cè)價(jià)值。材料與方法:選

7、取于2007-2011年在我院診治的223例確診為前列腺腺癌患者與40例非前列腺腺癌對(duì)照的前列腺組織切片，回顧性的收集患者臨床資料。通過免疫組化染色比較隊(duì)列中COL6A1的表達(dá)水平，并分析與臨床轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果:在多因素回歸中，Gleason評(píng)分(OR=4.204，95％CI=1.360 to12.999，p=0.013)，T分期(OR=43.912，95％CI=12.340 to156.263，p＜0.01)與COL6A1表達(dá)水平(