山銀花有效成分的分析和提取以及抑制巨噬細胞膽固醇蓄積作用的研究.pdf

1、第一部分:金銀花有效成分的分析
　　目的:對金銀花中主要有效成分進行分析。
　　方法:高效液相色譜(HPLC)法測定金銀花中綠原酸的含量,選用VP-ODS C18色譜柱(150mm×4.6mm),乙腈-0.4％磷酸溶液(13:87)為流動相,檢測波長為327nm;照紫外-可見分光光度(UV-VIS)法,500nm波長處測定金銀花溶液的吸光度,以蘆丁為對照品,計算金銀花中總黃酮的含量;HPLC法測定金銀花中木犀草苷的含量,選用

2、VP-ODS C18色譜柱(150mm×4.6mm),乙腈為流動相A,0.5%冰醋酸溶液為流動相B,按A(%)10→30,B(%)90→70,在0~30min內(nèi)梯度洗脫,檢測波長為350nm。
　　結(jié)果:綠原酸進樣量在0.2~1μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(r=0.9996),金銀花中綠原酸含量為2.72%。蘆丁濃度在8~40μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系(r=0.9998),金銀花中總黃酮含量為6.46%

3、。木犀草苷進樣量在0.08~0.4μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(r=0.9995),金銀花中木犀草苷含量為0.065%。
　　結(jié)論:綠原酸和總黃酮都是金銀花的主要有效成分。
　　第二部分:山銀花有效成分的提取以及抑制巨噬細胞膽固醇蓄積作用的研究
　　目的:考察山銀花提取物抑制巨噬細胞膽固醇蓄積的作用。
　　方法:運用中藥提取分離技術(shù),得到山銀花的乙醇提取物,按照溶液極性大小的不同,依次用石油醚、乙酸

4、乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相等不同的組分。以石油醚相(藥物1)、乙酸乙酯相(藥物2)、正丁醇相(藥物3)作為受試藥物。體外培養(yǎng)鼠源性巨噬細胞(RAW264.7細胞),不同濃度的脂肪乳(20%脂肪乳與培養(yǎng)基比例分別為0:1、1:6、1:5、1:4、1:2、1:1)孵育RAW264.7細胞,再以最佳濃度脂肪乳孵育細胞不同時間(0、3、6、12、24、48h),油紅 O染色法觀察細胞荷脂情況。進一步實驗將細胞分成

5、5組,即正常組、荷脂組(10%脂肪乳組)、10%脂肪乳+藥物1組、10%脂肪乳+藥物2組、10%脂肪乳+藥物3組,油紅O染色法觀察細胞內(nèi)脂粒變化,Western印跡法檢測小凹蛋白-1(caveolin-1)的表達,反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測SREBP-1的mRNA表達。
　　結(jié)果:油紅 O染色顯示,在一定濃度和時間范圍內(nèi),細胞中脂粒隨脂肪乳濃度升高和荷脂時間的延長而增多,10%脂肪乳荷脂24h使細胞荷脂情況最佳;不

6、同因素處理細胞24h,油紅O染色顯示,藥物1組、2組、3組均使荷脂細胞的脂粒減少,且藥物2組使脂粒減少最明顯。Western印跡結(jié)果顯示,荷脂組較正常組 caveolin-1表達下調(diào),藥物1、2、3組caveolin-1的表達均較荷脂組有上調(diào)趨勢,且藥物2組上調(diào)最明顯;免疫熒光檢測顯示,與荷脂組比較,藥物1、2、3組能上調(diào)caveolin-1表達,且藥物2組上調(diào)最明顯。RT-PCR結(jié)果顯示,荷脂組較正常組SREBP-1的mRNA表達上調(diào)