抗腫瘤效應(yīng)B細(xì)胞通過Fas-FasL途徑直接殺傷腫瘤細(xì)胞且受IL-10和IL-2調(diào)控.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩109頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、第一部分 IL-10調(diào)控4T1 TDLN B細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)
  目的:調(diào)控B細(xì)胞(Bregs)是一種調(diào)控免疫功能的 B細(xì)胞,在腫瘤免疫中通過其分泌的I L-10來抑制機(jī)體的抗腫瘤功能。為了確定IL-10+TDLN B細(xì)胞或IL-10在 WT4T1 TDLN B細(xì)胞抑制4T1腫瘤細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移中的作用,我們檢測 IL-10-/-和WT4T1 TDLN B細(xì)胞表達(dá)IL-10的情況,還比較了它們在體內(nèi)和體外的抗腫瘤作用,以及I L-10

2、抗體對WT4T1 TDLN B細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的影響。
  方法:為了獲得TDLNs,在4T1自發(fā)性乳腺癌肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型中我們將1×1064T1腫瘤細(xì)胞(在0.1ml的 PBS中)皮下接種到同源的 WT和IL-10-/- BALB/c小鼠側(cè)腹下部靠近腹股溝的地方。4T1腫瘤細(xì)胞接種9天后,處死小鼠,無菌條件下收集TDLNs。小鼠 LNs則直接取至正常 BALB/c小鼠。然后通過 CD19+微磁珠純化分選得到TDLN B細(xì)胞和正常LN

3、 B細(xì)胞,再用抗CD40(2μg/ml)和LPS(5μg/ml)體外激活擴(kuò)增 B細(xì)胞3-4天,此時(shí)的 TDLN B細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。我們對激活之前和之后的TDLN B細(xì)胞、正常LN B細(xì)胞進(jìn)行表型功能分析,激活之后的WT和IL-10-/-TDLN B細(xì)胞可以用來進(jìn)行過繼性免疫治療研究和體外細(xì)胞毒性檢測。為了獲得4T1荷瘤小鼠,我們將5×1044T1腫瘤細(xì)胞皮下接種到正常小鼠的乳腺脂肪墊中,誘導(dǎo)生成自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移腫瘤小鼠。14天后,通過尾靜脈

4、輸入3或15×106效應(yīng) WT和IL-10-/-TDLN B細(xì)胞對這些荷瘤小鼠進(jìn)行治療,或是輸入107效應(yīng) WT TDLN B細(xì)胞和IL-10抗體。28-29天后,處死所有的荷瘤小鼠并收集其肺和計(jì)算肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù),還要收集脾和外周血,并檢測每組小鼠的脾 T、B細(xì)胞,PBMCs T、B細(xì)胞在體外的細(xì)胞毒性作用。
  結(jié)果:我們比較了純化于WT和IL-10-/-4T1 TDLNs以及正常 LNs中的CD19+ B細(xì)胞,細(xì)胞流式檢測確定

5、CD19+和CD19+IL-10+ B細(xì)胞群,結(jié)果顯示磁珠分選后的CD19+ B細(xì)胞純度大于95%,且純化后的 WT B細(xì)胞中有2-3%的細(xì)胞是 CD19+IL-10+,而正如我們所預(yù)料的那樣在 IL-10-/- B細(xì)胞中幾乎沒有 IL-10+細(xì)胞存在。在體外用 LPS和抗CD40激活擴(kuò)增培養(yǎng)后,WT B細(xì)胞中CD19+IL-10+的細(xì)胞增加到了11%左右,但在 IL-10-/- B細(xì)胞中仍然沒有 CD19+IL-10+的細(xì)胞存在。另外

6、,在激活擴(kuò)增之前和之后的正常淋巴結(jié) B細(xì)胞中,也幾乎不含有 CD19+IL-10+細(xì)胞。我們還對比了 WT4T1 TDLN B細(xì)胞和IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞的免疫治療效果。和PBS空白對照組相比,僅IL-2或低劑量(3×106/mouse)WT4T1 TDLN B細(xì)胞治療并不能顯著性地減少肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié);高劑量(15×106/mouse)過繼性輸入WT4T1 TDLN B細(xì)胞能顯著性地抑制4T1腫瘤轉(zhuǎn)移到肺上(p<0.05)

7、。而且高劑量(15×106/mouse)WT4T1 TDLN B細(xì)胞和高劑量(15×106/mouse)IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞的抗腫瘤效果是相似的(p>0.05)。但是,與低劑量(3×106/mouse)WT4T1 TDLN B細(xì)胞相比較,過繼性輸入低劑量(3×106/mouse)IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞能顯著性地減少肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(p<0.05)。在體外,IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞或WT4T

8、1 TDLN B細(xì)胞都不能顯著性地殺傷Renca和TSA,但是 WT4T1 TDLN B細(xì)胞以劑量依賴性的方式殺傷4T1腫瘤細(xì)胞。在效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例為10:1和30:1時(shí),WT4T1 TDLN B細(xì)胞和IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞分別殺傷4T1的效率是沒有顯著性區(qū)別的;但在比例為3:1時(shí),IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞比WT4T1 TDLN B細(xì)胞殺傷4T1腫瘤細(xì)胞的效率更高(p<0.05)。而在4T1乳腺癌

9、自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型中,我們用IL-10抗體和WT4T1 TDLN B細(xì)胞過繼性輸入治療荷瘤小鼠,結(jié)果表明與單效應(yīng) WT TDLN B細(xì)胞或效應(yīng) WT TDLN B細(xì)胞加上IgG/IgG1相比,IL-10抗體和效應(yīng) WT TDLN B細(xì)胞能顯著性地減少乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移(p<0.01)。收集各組小鼠脾和外周血,比較其T和B細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,
  結(jié)果顯示:來源于WT4T1 TDLN B細(xì)胞和IL-10抗體治療組的PBMCs T細(xì)胞和

10、B細(xì)胞,它們比其它各對照組的T細(xì)胞和B細(xì)胞更能顯著性地殺傷4T1腫瘤細(xì)胞(p<0.05);來源于WT4T1 TDLN B細(xì)胞和IL-10抗體治療組的脾T細(xì)胞和B細(xì)胞,它們也比其它各對照組的T細(xì)胞和B細(xì)胞更能顯著性地殺傷4T1腫瘤細(xì)胞(p<0.05)。
  結(jié)論:在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在WT4T1 TDLN B細(xì)胞、IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞和正常LN B細(xì)胞中,只有WT B細(xì)胞在激活和擴(kuò)增之后都含有IL-10+的B細(xì)胞

11、。在體外,TDLN B細(xì)胞能以腫瘤特異性的方式直接殺傷腫瘤細(xì)胞,且IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞具有更高的直接殺傷腫瘤細(xì)胞效率;在體內(nèi)以單個(gè)細(xì)胞為單位時(shí),IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞比WT4T1 TDLN B細(xì)胞具有更高的抗腫瘤免疫效率。用IL-10抗體去除體內(nèi)的IL-10可增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤功能,從而提高效應(yīng)WT TDLN B細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移抑制作用。所以,在過繼性免疫治療中WT TDLN B細(xì)胞中的B

12、regs所生成的IL-10降低其抗腫瘤效應(yīng)。
  第二部分4T1 TDLN B細(xì)胞通過Fas/FasL途徑直接殺傷4T1腫瘤細(xì)胞且IL-2調(diào)控其在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)
  目的:根據(jù)前期研究成果,我們已經(jīng)證明效應(yīng) TDLN B細(xì)胞過繼性輸入能抑制腫瘤細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移,但其介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制仍然不是很清楚。為了探討效應(yīng)TDLN B細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的可能機(jī)制,我們檢測了 TDLN B細(xì)胞表達(dá) FasL和IL-2R的情況以及Fa

13、sL和IL-2的作用。
  方法:在4T1自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型中,為了獲得 TDLNs我們將4T1腫瘤細(xì)胞皮下接種到同源的WT和IL-10-/-BALB/c小鼠側(cè)腹下部靠近腹股溝的地方。4T1腫瘤細(xì)胞接種9天后,處死小鼠無菌條件下收集 TDLNs。然后通過 CD19+微磁珠分離純化得到TDLN B細(xì)胞,再用CD40抗體和LPS體外激活擴(kuò)增B細(xì)胞3-4天,此時(shí)的B細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。我們檢測了4T1腫瘤細(xì)胞 Fas的表達(dá)情況和就體外 L

14、DH釋放來評估 Ant-FasL對效應(yīng) B細(xì)胞細(xì)胞毒性的作用。激活之前和之后的 TDLN B細(xì)胞可以用來進(jìn)行表型功能分析。小鼠荷瘤14天后,對這些荷瘤小鼠進(jìn)行治療,即尾靜脈輸入107個(gè)效應(yīng) TDLN B細(xì)胞,同時(shí)加入或不加入 IL-2。28-29天后,處死所有的荷瘤小鼠并收集其肺和計(jì)算肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。
  結(jié)果:為了確定4T1 TDLN B細(xì)胞直接殺傷4T1腫瘤細(xì)胞是否含有 Fas/FasL途徑,我們通過檢測LDH釋放來評估4T1 T

15、DLN B細(xì)胞對4T1腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,另外還同時(shí)用anti-FasL阻斷FasL。結(jié)果顯示,4T1 TDLN B細(xì)胞和4T1腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)8-12小時(shí)后,在E:T的比例為10:1和30:1時(shí),與10μg/ml anti-FasL抗體相比,30μg/ml anti-FasL抗體能顯著性地降低4T1 TDLN B細(xì)胞的殺傷效率。流式檢測 IL-10-/-和WT4T1 TDLN B細(xì)胞的FasL表達(dá)情況,結(jié)果表明anti-CD40/L

16、PS激活培養(yǎng)WT4T1 TDLN B細(xì)胞后,有大約5%細(xì)胞表達(dá)FasL,而表達(dá)FasL的IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞為8%左右。WT4T1 TDLN B細(xì)胞分別以10:1和30:1與4T1細(xì)胞培養(yǎng)12 h后,表達(dá)FasL的B細(xì)胞從5.1%分別增加到13.5%和18.0%;IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞則分別增加到16.2%和14.3%。檢測Fas在4T1腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)時(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的4T1腫瘤細(xì)胞都表達(dá) F

17、as。另外,為了探討 IL-2在效應(yīng) B細(xì)胞過繼性免疫治療腫瘤中的作用,我們比較了WT4T1 TDLN B細(xì)胞或WT4T1 TDLN B細(xì)胞+IL-2對腫瘤的治療效果。結(jié)果顯示W(wǎng)T4T1 TDLN B細(xì)胞并不能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,但是WT4T1 TDLN B細(xì)胞和IL-2治療能顯著性地抑制了4T1腫瘤細(xì)胞從乳腺脂肪墊中轉(zhuǎn)移到肺上(p<0.01);與無治療組相比,僅 IL-2并不能顯著性地減少肺轉(zhuǎn)移灶(p>0.05)。單 IL-2或單4T1 T

18、DLN B細(xì)胞都沒有體內(nèi)抗腫瘤功能,只有兩者結(jié)合起來才能抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移。因此,我們檢測了4T1 TDLN B細(xì)胞 IL-2R(CD25)的表達(dá),激活之前 WT和IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞都有大約10%的細(xì)胞 IL-2R+;體外激活擴(kuò)增后,WT和IL-10-/-4T1 TDLN B細(xì)胞中IL-2R+的細(xì)胞又都增加了,分別提高到16.7%和17.9%。
  結(jié)論:通過研究我們發(fā)現(xiàn),IL-10-/-和WT4T1 TDLN

19、 B細(xì)胞都表達(dá)FasL且并沒有太大區(qū)別,和4T1細(xì)胞共培養(yǎng)后,表達(dá)FasL的B細(xì)胞都明顯地增加,4T1腫瘤細(xì)胞表達(dá)Fas。所以4T1 TDLN B細(xì)胞表面的FasL能與4T1腫瘤細(xì)胞表面的Fas結(jié)合并誘導(dǎo)4T1死亡,所以 TDLN B細(xì)胞通過Fas/FasL途徑殺死腫瘤細(xì)胞;它們還表達(dá) IL-2受體(IL-2 receptor,IL-2R/CD25),且 IL-2是效應(yīng) TDLN B細(xì)胞在體內(nèi)抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移的必要條件。IL-2可能是直

20、接調(diào)控作用于 TDLN B細(xì)胞。這些結(jié)果說明了效應(yīng)TDLN B細(xì)胞在過繼性免疫治療中的機(jī)制包含了Fas/FasL途徑和IL-2調(diào)控。
  第三部分過繼性輸入B細(xì)胞的體內(nèi)追蹤研究
  目的:我們已經(jīng)證實(shí)了效應(yīng)TDLN B細(xì)胞可以分泌IL-10,抑制其抗腫瘤效應(yīng),B細(xì)胞還通過Fas/FasL途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡,且B細(xì)胞表達(dá)IL-2R、IL-2使效應(yīng)TDLN B細(xì)胞具有在體內(nèi)抗腫瘤的功能。但是,效應(yīng) TDLN B細(xì)胞在過繼性輸入

21、后,在體內(nèi)遷移定位我們?nèi)允遣磺宄榱舜_定效應(yīng) TDLN B細(xì)胞在體內(nèi)的遷移定位,在效應(yīng)TDLN B細(xì)胞過繼性輸入前被標(biāo)記以便于我們對B細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)的追蹤定位。
  方法:為了獲得TDLNs,我們將4T1腫瘤細(xì)胞接種到WT BALB/c小鼠側(cè)腹下部靠近腹股溝的地方,4T1腫瘤細(xì)胞接種9天后,處死小鼠無菌條件下收集 TDLNs。然后通過 CD19+微磁珠純化分離得到 TDLN B細(xì)胞,再用 CD40抗體和LPS體外激活擴(kuò)增B細(xì)胞3-

22、4天,此時(shí)的B效應(yīng)細(xì)胞再被10μM CMTMR37℃避光孵育45 min。荷瘤小鼠4T1腫瘤細(xì)胞接種14天后,通過尾靜脈對這些荷瘤小鼠或正常小鼠輸入標(biāo)記的TDLN B細(xì)胞,分別在過繼性輸入后第1、5、9和14天時(shí),處死荷瘤小鼠和正常小鼠并收集其腫瘤、肺、脾和TDLN是,流式檢測這些組織器官中的標(biāo)記TDLN B細(xì)胞和計(jì)算其數(shù)目。
  結(jié)果:為了了解效應(yīng) TDLN B細(xì)胞在體內(nèi)的定位,CMTMR標(biāo)記 TDLN B細(xì)胞后進(jìn)行其體內(nèi)追蹤。

23、在輸入前結(jié)果表明 CMTMR100%標(biāo)記效應(yīng) TDLN B細(xì)胞。在過繼性治療第1、5、9、14天時(shí),流式檢測這小鼠的 TDLNs、脾、肺和腫瘤中活的標(biāo)記CD19+ B細(xì)胞。結(jié)果顯示過繼性輸入 B細(xì)胞在第9天時(shí),乳腺脂肪墊腫瘤和肺中所有CD19+ B細(xì)胞中所占的比例明顯較高。而且在第14天能明顯觀察到腫瘤肺轉(zhuǎn)移時(shí),輸入的B細(xì)胞在腫瘤和肺總B細(xì)胞中仍占較高比例,而過繼性輸入B細(xì)胞在TDLN和脾中所占比例一直都比較低。另外,與在荷瘤小鼠肺中輸

24、入的 B細(xì)胞相比,在正常小鼠肺中只有很低比例的 TDLN B細(xì)胞。根據(jù)流式結(jié)果計(jì)算4種組織器官中過繼性 B細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目,雖然過繼性B細(xì)胞在脾和TDLN的總B細(xì)胞中所占百分比較低,但是其實(shí)際數(shù)目卻比腫瘤和肺中的明顯要多一些(p>0.05)。
  結(jié)論:這些結(jié)果證明過繼性B細(xì)胞并不是優(yōu)先遷移到腫瘤的,但是過繼性B細(xì)胞比內(nèi)源性 B細(xì)胞更易于遷移到肺和腫瘤中。過繼性 TDLN B細(xì)胞可能直接作用于原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞來抑制腫瘤細(xì)胞

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論