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文檔簡介
1、糖尿病是由于胰島素分泌不足,胰島素作用異?;蚨呒嬗卸鴮?dǎo)致的以高血糖為主要臨床特點的一組代謝性疾病。2型糖尿病現(xiàn)已成為全球性重大公共衛(wèi)生問題,目前的研究結(jié)果表明血糖調(diào)節(jié)不僅與胰腺、肝臟、肌肉和脂肪的作用及相互作用有關(guān)而且與免疫系統(tǒng)、大腦和消化道所發(fā)出的信號有關(guān),更有新的研究結(jié)果顯示成骨細胞特異性分泌的蛋白——骨鈣素(Osteocalcin,Bone Gla protein,BGP,OC)在血糖調(diào)節(jié)中也發(fā)揮了重要的作用。
骨
2、鈣素為成骨細胞特異性分泌的一種蛋白,在維生素K依賴性羧化酶的作用下,其17,21,24位上的谷氨酸殘基羧化為羧化谷氨酸,含有未羧化谷氨酸殘基的骨鈣素稱為羧化不全骨鈣素。此外骨鈣素羧化還受成骨細胞特異性表達基因Esp(亦稱PTPRV)基因編碼的一個新的受體樣酪氨酸磷酸酶OST-PTP蛋白(Osteotesticular Protein Tyrosine Phosphatase)的調(diào)節(jié)。
既往研究多認為骨鈣素是骨形成及骨轉(zhuǎn)換的
3、標(biāo)志,然而既往的研究只是將骨鈣素做為骨轉(zhuǎn)換的標(biāo)志從其在糖尿病人群中的變化的角度來研究糖尿病患者的骨代謝,并沒有注意到它可能會影響糖脂代謝。直到Lee等(2007)在骨鈣素基因缺失的小鼠上發(fā)現(xiàn)這些小鼠較野生型小鼠血糖水平升高、胰島素水平降低、胰島素敏感性降低、胰島細胞增殖減少,能量支出減少,不能耐受血糖并且肥胖,人們才注意到骨鈣素可能是一種骨組織分泌的激素參與能量代謝的調(diào)節(jié),且只有羧化不全骨鈣素才具有促進胰島素分泌、增強胰島素敏感性而且可
4、降低血清甘油三酯含量及體內(nèi)脂肪的含量。推測成骨細胞可感知血糖濃度的變化并能通過調(diào)節(jié)羧化不全骨鈣素水平來參與血糖調(diào)節(jié)。本實驗擬探討在不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基中成骨細胞羧化不全骨鈣素分泌水平的變化。
越來越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病多伴有骨鈣素水平的變化,2型糖尿病患者血清骨鈣素水平明顯降低,且與骨密度無關(guān),在血糖控制改善后其水平恢復(fù)正常。在健康者的橫斷面研究表明體質(zhì)指數(shù)BMI<25/kg/m2個體其循環(huán)中骨鈣素水平與胰島素敏感
5、性成線性關(guān)系。在絕經(jīng)后的婦女的研究表明2型糖尿病患者其骨鈣素水平較血糖正常者及IGT患者其骨鈣素水平明顯降低。骨鈣素處于最高四分位值者其空腹血糖及糖化血紅蛋白水平較骨鈣素處于最低四分位值者明顯降低。此外骨鈣素水平與血糖、胰島素、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗成負相關(guān),多元回歸分析表明血清骨鈣素是與血糖、糖化血紅蛋白相關(guān)的獨立的因子。在老年人中的研究發(fā)現(xiàn)血清骨鈣素濃度與空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、體重指數(shù)、體脂呈負相關(guān)。本研究擬比較不
6、同糖耐量者其骨鈣素水平并探討骨鈣素與各代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。
本課題擬探討以下兩個方面的內(nèi)容:
1.成骨細胞對血糖感知作用:探討在不同濃度的葡萄糖情況下成骨細胞羧化不全骨鈣素分泌水平的變化。
2.比較不同糖耐量者其骨鈣素水平并探討骨鈣素與各代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。
第1章成骨細胞對血糖感知作用的研究
1.研究目的
探討不同濃度的血糖情況下成骨細胞羧化不全骨
7、鈣素分泌水平的變化。
2.材料和方法
2.1實驗材料
2.1.1肋骨標(biāo)本
來自胸部創(chuàng)傷手術(shù)切除之肋骨,取標(biāo)本前獲得患者及其家屬知情同意。
2.2實驗方法
2.2.1人成骨細胞的分離和培養(yǎng)
將手術(shù)切除之肋骨以PBS徹底清洗,清除軟組織,將其咬碎,暴露小梁骨面,切下骨小梁并將之剪碎,置于培養(yǎng)皿中,將骨小梁以無菌的PBS徹底清洗以移除血液成分,以
8、0.25%胰酶(含0.02%EDTA)于37℃消化半小時,終止消化并以PBS徹底沖洗直至于倒置顯微鏡下觀察骨片表面及清洗液中無粘著及漂浮的細胞,以DMEM完全培養(yǎng)液清洗骨小梁一次,將其移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng),補足培養(yǎng)液密閉后置5%CO2、37℃飽和濕度下培養(yǎng),每周更換培養(yǎng)液一次。
2.2.2人成骨細胞的鑒定
2.2.2.1堿性磷酸酶組織化學(xué)染色-偶氮偶聯(lián)法
參照李家增主編《血液實驗學(xué)》之Kaplow偶
9、氮偶聯(lián)染色法并加以改良。
2.2.2.2骨鈣素免疫熒光組化染色
依照免疫熒光組化染色步驟進行。
2.2.2.3鈣-茜素紅染色:
參照Thomas染色法
2.2.3不同濃度葡萄糖對成骨細胞羧化不全骨鈣素分泌水平的影響
2.2.3.1細胞分組及處理
將傳二三代成骨細胞以5×104個細胞接種于6孔板中分成5組,待細胞融合至80%以含不同濃度葡萄糖
10、的培養(yǎng)基(濃度分別為5.6,7.6,9.6,12.6,20.6mmol/L)刺激成骨細胞并同時加入維生素K2使其在培養(yǎng)液中的最終濃度為10-5mol/L,半小時后收集上清液-20℃冰箱凍存待用,觀察血糖對成骨細胞羧化不全骨鈣素分泌水平的影響。
2.2.3.2上清中羧化不全骨鈣素率
2.2.3.2.1上清中總骨鈣素水平測定:
按骨鈣素測定放免試劑盒說明書進行。
2.2.3.2.2上清
11、中羧化不全骨鈣素測定(依照Sokoll’法)
同步取100μL上清液,加入100g/L硫酸鋇100μL,振蕩30min,4℃離心5min,按骨鈣素測定放免試劑盒說明書進行測定上清液中羧化不全骨鈣素含量。
2.2.3.2.3羧化不全骨鈣素率計算
羧化不全骨鈣素率=羧化不全骨鈣素/骨鈣素×100%。
2.2.4統(tǒng)計學(xué)分析:
應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,采用On
12、e—way ANOVA,組間比較用SNK法,檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。
3.結(jié)論
在一定葡萄糖濃度范圍內(nèi)(5.6~9.6 mmol/L)成骨細胞羧化不全骨鈣素分泌水平隨葡萄糖濃度增加而增加,而當(dāng)進一步提高葡萄糖濃度20.6 mmol/L時成骨細胞分泌羧化不全骨鈣素水平反而降低。
第2章不同糖耐量者血清骨鈣素水平的比較性研究
1.研究目的
比較不同糖耐量者其骨鈣素水平并探
13、討骨鈣素與各代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。
2.研究方法
2.1對象
根據(jù)WHO1999年診斷標(biāo)準(zhǔn),收集門診及住院患者,其中正常糖耐量組(NGT)13人、空腹血糖調(diào)節(jié)受損組(IFG)10人、新診斷的2型糖尿病(172DM)29人,排除肝硬化、腫瘤、腎功能異常、曾患骨折及服用影響骨代謝的藥物(二膦酸鹽、降鈣素、雌激素、阿法骨化醇)及絕經(jīng)婦女。
所有受試者均于電子體重計上赤足測定身高和體重,并
14、根據(jù)公式:體重(Kg)/身高平方米(m2)計算BMI(Rg/m2)。
2.2.2口服葡萄糖耐量.胰島素釋放試驗(OGTT)
受試者禁食至少12小時后在清晨空腹抽取肘靜脈血,然后口服75克葡萄糖(溶于300ml水中,5分鐘內(nèi)飲完),2小時后再抽取肘靜脈血。采用葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度,化學(xué)發(fā)光法測定血漿胰島素水平。
2.2.3計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)
胰島素抵抗指數(shù)HO
15、MA-IR=(FINS×FPG)/22.5。
2.2.4生化分析
同步采集受試者患者的血液樣品。于全自動生化分析儀上測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)。
2.2.5骨鈣素測定:
按試劑盒說明書進行。
2.3統(tǒng)計學(xué)處理
統(tǒng)計學(xué)方法包括方差分析、協(xié)方差分析,相
16、關(guān)分析,統(tǒng)計處理均使用軟件SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。各項參數(shù)以x±sD表示。不同組別間的比較采用單因素方差分析,BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c及HOMA-IR與BGP的相關(guān)性比較采用Person相關(guān)分析。
3.結(jié)論
本研究表明三組之間骨鈣素水平比較有統(tǒng)計學(xué)意義,NGT、IGT、T2DM組彼此之間有統(tǒng)計學(xué)意義,經(jīng)過年齡、胰島素水平校正后三組之間及各組別之間仍有統(tǒng)計學(xué)意義。2型糖尿
17、病患者其骨鈣素水平較血糖正常者及IGT患者其骨鈣素水平明顯降低,其濃度從NGT到IGT再到糖尿病逐漸降低。相關(guān)分析表明骨鈣素與空腹血糖、糖化血紅蛋白(HbA1C)、HOMA-IR成負相關(guān)。骨鈣素與TC、LDL-C成負相關(guān),但相關(guān)關(guān)系不密切。骨鈣素與體重指數(shù)、空腹胰島素、TG、HDL-C無相關(guān)關(guān)系。骨鈣素在血糖調(diào)節(jié)方面可能有潛在的作用,骨鈣素可能作為內(nèi)分泌系統(tǒng)的一部分參與能量代謝的調(diào)節(jié)。
總結(jié)
1.成骨細胞可感
18、知葡萄糖濃度的變化并調(diào)節(jié)自身羧化不全骨鈣素分泌水平。在一定葡萄糖濃度范圍內(nèi)(5.6~9.6 mmol/L)成骨細胞羧化不全骨鈣素分泌水平隨葡萄糖濃度增加而增加,而當(dāng)進一步提高葡萄糖濃度達20.6 mmol/L時成骨細胞分泌羧化不全骨鈣素水平反而降低。
2.2型糖尿病患者其骨鈣素水平較血糖正常者及IGT患者其骨鈣素水平明顯降低。相關(guān)分析表明骨鈣素與空腹血糖、糖化血紅蛋白(HbA1C)、HOMA-IR成負相關(guān)。骨鈣素與TC、L
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