護(hù)骨素與2型糖尿病血管并發(fā)癥的研究.pdf

1、研究背景：2型糖尿病的發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。2型糖尿病的主要危害是糖尿病所致的各種嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，包括大血管并發(fā)癥，如冠心病、腦梗塞、外周動(dòng)脈硬化等，以及微血管并發(fā)癥，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和神經(jīng)病變等。防治糖尿病所致的大血管及微血管并發(fā)癥是糖尿病領(lǐng)域的主要任務(wù)，但糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。非酶蛋白糖化、多元醇通道途徑激活、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及免疫因素等是糖尿病慢性并發(fā)癥的可能發(fā)

2、病機(jī)制之一，但上述因素并不能解釋糖尿病慢性并發(fā)癥的全部機(jī)制。是否還存在其它機(jī)制仍是目前糖尿病研究領(lǐng)域的重要課題之一。護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）是1997年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體家族新成員，它的主要生物學(xué)作用是抑制破骨細(xì)胞形成、分化、存活并誘導(dǎo)其凋亡，對(duì)于骨代謝有重要意義。近來研究發(fā)現(xiàn)，OPG亦是一重要的血管調(diào)節(jié)因子，與動(dòng)脈粥樣硬化和血管鈣化相關(guān)聯(lián)，可能在血管疾病

3、的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用。國外許多學(xué)者研究了血清OPG水平與冠心病及外周動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清OPG水平不僅與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化的存在顯著相關(guān)，而且與其嚴(yán)重程度有明顯關(guān)系，高血清OPG水平是發(fā)生冠心病和心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。糖尿病的慢性并發(fā)癥主要是大血管和微血管并發(fā)癥，是否OPG與糖尿病的慢性并發(fā)癥有關(guān)？關(guān)于此方面的研究國內(nèi)未見報(bào)道，國外的報(bào)道亦較少，部分研究結(jié)果表明，糖尿病并冠心病患者或糖尿病并微血管病變患者的血

4、清OPG水平升高，因此OPG可能與糖尿病的慢性血管并發(fā)癥有關(guān)。本課題主要系統(tǒng)研究OPG與2型糖尿病血管并發(fā)癥的關(guān)系，為糖尿病并發(fā)癥的研究提供新的思路。 目的：第一部分：應(yīng)用ELISA法檢測(cè)2型糖尿病并大血管病變患者的血清OPG水平，同時(shí)應(yīng)用PCR-RELP測(cè)定OPG950T-C基因多態(tài)性。以其探討（1）血清OPG水平與2型糖尿病并大血管病變的關(guān)系。（2）2型糖尿病并大血管病變患者血清OPG水平與FPG、2hPG、HbA1c、血脂

5、、胰島素抵抗及hsCRP等指標(biāo)的關(guān)系，進(jìn)一步研究糖尿病并大血管病變的相關(guān)危險(xiǎn)因素。（3）OPG950T-C基因多態(tài)性是否與糖尿病大血管病變有關(guān)。通過以上研究了解OPG在糖尿病大血管并發(fā)癥中的作用及意義。第二部分：應(yīng)用ELISA法測(cè)定2型糖尿病并腎病患者的血清OPG水平，同時(shí)對(duì)部分糖尿病腎病患者行腎活檢，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)OPG在糖尿病腎組織中的表達(dá)。以其探討（1）血清OPG與2型糖尿病腎病及其嚴(yán)重程度的關(guān)系。（2）OPG在腎組織中的表

6、達(dá)與糖尿病腎病及其嚴(yán)重程度的關(guān)系。（3）糖尿病腎病患者血清OPG水平與血糖控制、炎性指標(biāo)、血脂、胰島素抵抗等指標(biāo)的相關(guān)性，進(jìn)一步研究糖尿病腎病的相關(guān)危險(xiǎn)因素。第三部分：應(yīng)用ELISA法測(cè)定2型糖尿病并視網(wǎng)膜病變患者的血清OPG水平。以其探討：（1）血清OPG水平與糖尿病視網(wǎng)膜病變及其嚴(yán)重程度的關(guān)系。（2）糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的相關(guān)危險(xiǎn)因素以及與血清OPG水平的關(guān)系。 材料與方法： 第一部分： 1.病例選擇：200

7、6年3月至2008年9月在山東省濰坊醫(yī)學(xué)院附屬青州醫(yī)院內(nèi)分泌科、心內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科住院和門診的2型糖尿病患者168例。根據(jù)有無大血管病變分為大血管病變組86例和無大血管病變組82例。另選擇年齡、性別相匹配的40例健康者為對(duì)照組。 2.標(biāo)本留?。核袀€(gè)體空腹12h后次晨抽靜脈血，進(jìn)行生化指標(biāo)的測(cè)定。采取靜脈血，分離血清后-70℃保存，集中測(cè)定血OPG水平。抽取靜脈血肝素抗凝，-70℃保存，集中行OPG基因多態(tài)性的測(cè)定。 3.

8、試驗(yàn)方法 （1）血清OPG水平應(yīng)用ELISA法測(cè)定。血糖采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定。利用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定空腹胰島素（Fins）。胰島素抵抗指數(shù)采用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法（HOMA-IR）計(jì)算。HbA1c采用NycoCard ReaderⅡ金標(biāo)定量檢測(cè)儀測(cè)定。hsCRP采用免疫比濁法測(cè)定。血脂指標(biāo)應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。 （2）OPG950T-C基因多態(tài)性的測(cè)定：①DNA的提取：引物的設(shè)計(jì)：上游序列：5’-CCCAGGGGCCAGAC

9、ACCAC-3’，下游序列：5’-GCGCGCAGCACAGCAACTT-3’，目的片段長度330bp。②PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系：模板2ul；10×PCR Buffer5ul；25mM MgCL24ul；4×dNTP1ul；上游引物P10.5ul；下游引物P20.5ul； Taq酶2U；超純水36ul；液體石蠟30ul。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物于1.2％瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，紫外線透射儀上觀察結(jié)果，拍照或掃描保存。

10、③PCR產(chǎn)物的酶切：應(yīng)用HincⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，HincⅡ限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物15μl；10×buffer2μl； HincⅡ1.5μl；超純水1.5μl。37℃水浴反應(yīng)4h，取10μl于1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果以x±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，比較有差異者進(jìn)行兩兩比較。各變量之間的關(guān)系用spearman相關(guān)分析，多因素相關(guān)分析采用Logistic回歸分析。統(tǒng)計(jì)

11、軟件為SPSS12.0。 第二部分： 1.病例選擇：2006年3月至2008年9月在山東省濰坊醫(yī)學(xué)院附屬青州醫(yī)院內(nèi)分泌科、腎內(nèi)科住院和門診的2型糖尿病患者110例。根據(jù)24h尿白蛋白排泄率（UAER），分為正常白蛋白尿組38例，微量白蛋白尿組36例，大量白蛋白尿組36例。另選擇年齡、性別相匹配的40例健康者為對(duì)照組。 2.標(biāo)本留?。核袀€(gè)體空腹12h后次晨抽靜脈血，進(jìn)行生化指標(biāo)的測(cè)定。采取靜脈血，分離血清后-70

12、℃保存，集中測(cè)定血OPG水平。所有患者留取24小時(shí)尿，記錄尿量，混勻后取2 ml送檢測(cè)定尿微量白蛋白。腎活檢標(biāo)本的采集：微量蛋白尿及大量蛋白尿組的部分患者經(jīng)病人及家屬同意，簽訂腎活檢協(xié)議書。局麻、B超引導(dǎo)下，應(yīng)用腎活檢針，采集腎組織2-4條，石蠟包埋，切片行HE染色和免疫組化檢查。 3.試驗(yàn)方法 （1）血清OPG水平應(yīng)用ELISA法測(cè)定。血糖采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定。利用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定空腹胰島素。胰島素抵抗指數(shù)采用HOMA

13、-IR計(jì)算。HbA1c和尿微量白蛋白采用NycoCard ReaderⅡ金標(biāo)定量檢測(cè)儀測(cè)定。hsCRP采用免疫比濁法測(cè)定。血脂指標(biāo)應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。 （2）腎活檢組織OPG免疫組化染色：采用即用型免疫組化染色試劑盒，一抗：兔抗人OPG多克隆抗體；二抗：親和純化抗體，山羊抗兔IgG。結(jié)果判定以染色呈棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，染色結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞顯色深淺及陽性細(xì)胞百分率分級(jí)分別進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)相加得分判定表達(dá)強(qiáng)弱。 4.統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)處理：結(jié)果以x±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，比較有差異者進(jìn)行兩兩比較。各變量之間的關(guān)系用spearman相關(guān)分析，多因素相關(guān)分析采用多元回歸分析。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS12.0。 第三部分： 1.病例選擇：2006年3月至2008年9月在山東省濰坊醫(yī)學(xué)院附屬青州醫(yī)院內(nèi)分泌科、眼科住院和門診的2型糖尿病患者98例。根據(jù)有無眼底視網(wǎng)膜病變分為無眼底病變組38例，背景期視網(wǎng)膜病變組30例和增殖期視網(wǎng)膜病變組30例。

15、 2.標(biāo)本的留取與檢測(cè)：所有個(gè)體空腹12h后次晨抽靜脈血，進(jìn)行生化指標(biāo)的測(cè)定。采取靜脈血，分離血清后-70℃保存，集中測(cè)定血OPG水平。血清OPG水平應(yīng)用ELISA法測(cè)定。其它血清指標(biāo)的檢測(cè)同第一部分。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果以x±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，比較有差異者進(jìn)行兩兩比較。各變量之間的關(guān)系用spearman相關(guān)分析，多因素相關(guān)分析采用Logistic回歸分析。 結(jié)論： 1.2型糖尿病并大血管病變

16、、并腎病、并眼底視網(wǎng)膜病變患者血清護(hù)骨素水平顯著高于無并發(fā)癥者，且與嚴(yán)重程度有關(guān)；血清OPG水平是糖尿病血管病變的獨(dú)立影響因素，說明血清OPG水平與糖尿病血管并發(fā)癥有關(guān)，OPG在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中可能起一定作用，血清OPG水平升高可作為糖尿病血管病變的標(biāo)志物。 2.2型糖尿病并血管并發(fā)癥患者血清護(hù)骨素水平與FPG、2hPG、HbA1C、HOMA-IR、hsCRP呈明顯正相關(guān)，表明血清護(hù)骨素水平的升高與血糖控制、胰島素