骨和腎組織相關(guān)信號因子在2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以骨量丟失、骨微細結(jié)構(gòu)改變而易發(fā)脆性骨折的全身性代謝疾??；2型糖尿病是以胰島素分泌不足與胰島素抵抗為主要特征，導致體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂的一種全身性代謝性疾病。由于生活方式和環(huán)境改變，二者發(fā)病率逐年增加。雖然傳統(tǒng)意義上二者是完全獨立分開的兩種疾病，但越來越多的研究證據(jù)表明骨質(zhì)疏松癥和2型糖尿病之間相互影響彼此相關(guān)，二者間可能存在共同的病理生理機制，但究竟二者之間通過什么途徑或機制

2、相互關(guān)聯(lián)并不清楚。近年來，相關(guān)研究認為骨和腎組織是可同時影響骨質(zhì)疏松和2型糖尿病發(fā)生和進展的兩大重要靶器官，而是否同時存在某些機制或偶聯(lián)因子通過腎和骨共同影響骨質(zhì)疏松和2型糖尿病發(fā)生發(fā)展尚無明確報道。
　　胰島素信號通路在2型糖尿病發(fā)病中起重要作用，尤以胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、胰島素受體底物-1(insulinreceptor substrate-1，IRS-1

3、)和胰島素受體底物-2(insulin receptorsubstrate-2，IRS-2)作用明顯。胰島素信號通路受抑制可致胰島素抵抗發(fā)生進而引發(fā)2型糖尿?。换蜓芯堪l(fā)現(xiàn)IGF-1、IRS-1和IRS-2缺失或表達降低均可致不同程度骨量下降和骨結(jié)構(gòu)異常，同時有研究表明骨和腎組織可表達IGF-1、IRS-1或IRS-2，但三者在2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松骨和腎組織表達如何尚不清楚。維生素D是影響骨生長和礦化的重要激素，其活性形式1，25(O

4、H)2D3在體內(nèi)合成依賴腎、骨和腸結(jié)構(gòu)和功能完整，而1，25(OH)2D3發(fā)揮作用又需與維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)結(jié)合。眾所周知1，25(OH)2D3缺乏可致骨量減少和骨質(zhì)疏松發(fā)生，而近年來許多研究發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3缺乏與2型糖尿病關(guān)系密切，成纖維細胞樣生長因子23(fibroblast growth factor23，F(xiàn)GF23)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bonemorphogenetic prot

5、ein7，BMP7)是近年來新發(fā)現(xiàn)可表達于骨和腎的重要因子，二者對1，25(OH)2D3有調(diào)節(jié)作用且可影響VDR表達，但VDR、FGF23和BMP7在2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松腎和骨同時表達如何尚無報道。2型糖尿病對骨質(zhì)疏松的影響，較明確的是可通過影響成骨細胞抑制骨形成過程，成纖維細胞樣生長因子2(fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF2)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP

6、2)是影響成骨細胞生長和作用的重要成骨因子，二者的表達異?；蛉笔Э芍鲁晒沁^程受抑制，兩種因子均可于腎和骨組織表達，且二者在2型糖尿病中表達不一，但FGF2和BMP2在2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松腎和骨的表達如何尚無明確報道。
　　本研究在既往研究成功制備2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠模型的基礎(chǔ)上，對腎和骨共同表達但機制不同的相關(guān)因子進行分析，明確這些因子在2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠腎和骨組織的表達，探討其表達意義，對2型糖尿病和骨質(zhì)疏松發(fā)病

7、機制提供新思路。
　　方法：
　　第一部分：在既往研究制備2型糖尿病骨質(zhì)疏松模型成功的基礎(chǔ)上，于去卵巢術(shù)后4、8、12周每組大鼠隨機選取5只拉頸處死，分離雙側(cè)股骨、脛骨、腎組織，取部分腎組織置4%多聚甲醛保存行腎組織病理學觀察組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學染色觀察NS組、NOVX組、DS和DOVX組腎組織IGF-1、IRS-1和IRS-2的表達部位，應(yīng)用IHS評分觀察各組陽性表達情況。雙側(cè)股骨、脛骨和部分腎組織液氮冷凍后-

8、80℃保存行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)實驗觀察各組骨和腎組織IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表達，應(yīng)用蛋白印跡法觀察12周各組腎組織IGF-1、IRS-1和IRS-2的蛋白表達情況。
　　第二部分：于去卵巢術(shù)后4、8、12周末每組大鼠隨機選取5只拉頸處死，分離雙側(cè)股骨、脛骨、腎組織，取部分腎組織置4%多聚甲醛保存行免疫組織化學染色觀察NS組、NOVX組、DS和DOVX組腎組織VDR、FGF23和BMP7的表達部位，應(yīng)用IHS評

9、分觀察各組陽性表達情況。雙側(cè)股骨、脛骨和部分腎組織液氮冷凍后-80℃保存行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)實驗觀察各組骨和腎組織VDR、FGF23和BMP7的mRNA表達，應(yīng)用蛋白印跡法觀察12周各組腎組織VDR、FGF23和BMP7的蛋白表達情況。
　　第三部分：于去卵巢術(shù)后4、8、12周末每組大鼠隨機選取5只拉頸處死，分離雙側(cè)股骨、脛骨、腎組織，取部分腎組織置4%多聚甲醛保存行免疫組織化學染色觀察各組腎組織FGF2和BMP2的表達部位，應(yīng)用

10、IHS評分觀察各組陽性表達情況。雙側(cè)股骨、脛骨和部分腎組織液氮冷凍后-80℃保存行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)實驗觀察各組骨和腎組織FGF2和BMP2的mRNA表達，應(yīng)用蛋白印跡法觀察12周各組腎組織FGF2和BMP2的蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分：與非糖尿病組(NS組和NOVX組)相比，糖尿病組(DS組和DOVX組)大鼠腎組織HE染色觀察到腎小球體積增大、髓袢腔擴張。應(yīng)用免疫組化方法觀察到各組大鼠腎組織均可見IGF-1、

11、IRS-1和IRS-2陽性表達，其表達部位為腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)。IHS評分示隨著病程時間延長，DOVX組IGF-1、IRS-1和IRS-2陽性表達均不同程度低于其他三組，且以12周為著。骨組織RT-PCR結(jié)果示DS組和DOVX組IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表達在4周、8周和12周均較其對照NS組和NOVX組有不同程度下降，NOVX組IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表達在12周均較DS組下降(P<0.05)，

12、12周時DOVX組IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表達均最低(P<0.05)。腎組織RT-PCR結(jié)果示NOVX組IRS-1和IRS-2的mRNA表達在4周、8周、12較NS組下降(P<0.05)，8周和12周時DS組IGF-1的mRNA表達較NOVX組下降(P<0.05)，12周時DOVX組IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表達最低。12周腎組織Westernblot蛋白表達結(jié)果示DOVX組和DS組IGF-1蛋白表

13、達低于NOVX和NS組，DS組低于NOVX組(P<0.05)；DOVX和DS組IRS-1和IRS-2蛋白表達低于NS組(P<0.05)，但NOVX組和NS組比較無明顯差別。
　　第二部分：應(yīng)用免疫組化方法觀察到各組大鼠腎組織均可見VDR、FGF23和BMP7陽性表達，其表達部位為腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)。IHS評分示隨著病程時間延長，DOVX組和NOVX組VDR陽性表達低于NS組(P<0.05)，12周DS組低于NS組(P<0.05)

14、；8周和12周DOVX組和DS組FGF23陽性表達較NOVX組和NS組明顯增加，DOVX組表達最高(P<0.05)；隨著周數(shù)延長DOVX和DS組BMP7陽性表達較NS組降低，且DOVX組表達最低(P<0.05)。骨組織RT-PCR結(jié)果示DS組和DOVX組VDR、FGF23和BMP7的mRNA表達在4周、8周、12周均較其對照NS組和NOVX組有不同程度下降，且12周時NOVX組VDR和BMP7較NS組mRNA表達明顯下降(P<0.05)

15、，DOVX組VDR、FGF23和BMP7的mRNA表達均最低(P<0.05)。腎組織RT-PCR結(jié)果示DS組和DOVX組VDR和BMP7的mRNA表達在4周、8周和12周均較NS組和NOVX組有不同程度下降，以DOVX組表達最低，同時DS組BMP7的mRNA表達低于NOVX組(P<0.05)；而DS組和DOVX組腎組織FGF23的mRNA表達在8周和12周較NS組明顯升高(P<0.05)，以DOVX組表達最高。12周腎組織Western

16、 blot蛋白表達結(jié)果示DOVX組和NOVX組VDR蛋白表達低于DS和NS組，NOVX組低于DS組(P<0.05)；DOVX和DS組BMP7蛋白表達低于NS組，且DS組BMP7蛋白表達低于NOVX組(P<0.05)；DOVX和DS組FGF23蛋白表達明顯高于NS組，且DOVX組明顯高于NOVX組(P<0.05)。
　　第三部分：應(yīng)用免疫組化方法觀察到各組大鼠腎組織均可見FGF2和BMP2陽性表達，其表達部位為腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)。

17、IHS評分示隨著病程時間延長，DS組FGF2陽性表達高于于NS組和NOVX組(P<0.05)；8周和12周DOVX組和DS組BMP2陽性表達較NOVX組和NS組明顯降低，DOVX組表達最低(P<0.05)。骨組織RT-PCR結(jié)果示4周、8周和12周時DOVX組和NOVX組FGF2和BMP2表達較NS組表達下降(P<0.05)；12周時NOVX組FGF2和BMP2表達低于DS組(P<0.05)；兩者DOVX組表達最低。腎組織RT-PCR結(jié)

18、果示4周時各組FGF2和BMP2表達比較無明顯差別(P>0.05)；8周和12周時DOVX組和NOVX組FGF2和BMP2表達較NS組表達下降，但DS組FGF2表達高于NS組(P<0.05)，12周時NOVX組FGF2表達最低，DOVX組和DS組BMP2表達無明顯差別(P>0.05)。12周腎組織Western blot蛋白表達結(jié)果示DS組FGF2蛋白表達高于其他三組(P<0.05)；NOVX組和DS組BMP2蛋白表達低于NS組，NOV

19、X組和DS組無明顯差別，DOVX組BMP2蛋白表達最低(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　12型糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠骨和腎組織IGF-1、IRS-1和IRS-2表達均有不同程度降低，腎和骨組織胰島素信號通路偶聯(lián)改變可為研究2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松發(fā)生提供新思路；
　　22型糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠骨和腎組織FGF23表達與VDR和BMP7不一致，為研究維生素D在2型糖尿病和骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用提供思路；
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