利用家蠶幾丁質(zhì)酶Bmchi提高球孢白僵菌的毒力.pdf

1、昆蟲病原真菌是一類重要的害蟲生防微生物，在農(nóng)、林以及衛(wèi)生害蟲的生物防治中顯示了良好的應(yīng)用前景。然而作為殺蟲劑，昆蟲病原真菌存在擊倒害蟲速度緩慢和防效不穩(wěn)定等不足，在一定程度上限制了真菌殺蟲劑的應(yīng)用范圍。研究表明，利用基因工程超量表達(dá)一個或多個毒力基因是提高菌株毒力的一條有效的途徑，其關(guān)鍵是獲得有效的目的基因。目前，可供菌株改良的毒力基因資源非常有限，主要來源于菌株自身。由于昆蟲病原真菌侵染致病的分子機(jī)理研究相對滯后，從病原菌鑒定新的毒力

2、基因進(jìn)展緩慢。因此，嘗試篩選其它物種來源的毒力基因以改良昆蟲病原真菌的毒力，是一條值得探索的途徑。 昆蟲病原真菌在侵染宿主過程中產(chǎn)生一系列水解酶(如幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等)，降解昆蟲體壁，促進(jìn)菌絲穿透。而病原真菌的宿主昆蟲在發(fā)育的關(guān)鍵時期，也產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶參與體壁的降解，協(xié)助完成昆蟲蛻皮等的發(fā)育過程。而且，昆蟲幾丁質(zhì)酶僅在幼蟲蛻皮、化蛹和羽化階段才有表達(dá)。若昆蟲不合適宜的產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶可能會對其生長造成不利影響，如在飼料中添加昆蟲幾丁質(zhì)

3、酶造成了昆蟲的死亡(Ding，1995)。這些研究結(jié)果啟示我們，是否可以利用昆蟲幾丁質(zhì)酶高效降解體壁的能力來改良昆蟲病原真菌的毒力? 基于此，本文選擇家蠶蛻皮過程中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶(Bmchi)作為研究對象，嘗試?yán)闷涓牧祭ハx病原真菌毒力。首先，利用酵母表達(dá)Bmchi基因和缺失了幾丁質(zhì)結(jié)合域的 Bmchi△c基因，分析其酶學(xué)特性，進(jìn)一步將兩個基因轉(zhuǎn)入球孢白僵菌組成性表達(dá)，分析它們對菌株毒力的影響，為利用昆蟲來源的幾丁質(zhì)酶基因改良?xì)?/p>

4、蟲真菌毒力提供依據(jù)。 酶學(xué)特性分析表明，幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)锥≠|(zhì)酶Bmchi的酶學(xué)性能有重要影響：(1)缺失幾丁質(zhì)結(jié)合域削弱了幾丁質(zhì)酶(Bmchi)對不溶性幾丁質(zhì)底物的結(jié)合能力，降低了幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)底物的活性；(2)缺失幾丁質(zhì)結(jié)合域改變了幾丁質(zhì)酶(Bmchi)的最適反應(yīng)的 pH值和最適反應(yīng)溫度。如Bmchi的最適反應(yīng)pH是8，最適反應(yīng)溫度為25℃，而Bmchi△c的最適反應(yīng)pH值為7，最適反應(yīng)溫度為35℃；(3)缺失幾丁質(zhì)結(jié)合域

5、降低了幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性。在40℃分別處理15min和30min后，Bmchi的相對活性分別是Bmchi△c的1.6倍和2.2倍： 在50℃處理60 min后，Bmchi和Bmchi△c的相對活性則分別穩(wěn)定在25％和14％左右。分別將Bmchi基因和Bmchi△c基因轉(zhuǎn)入球孢白僵菌組成性表達(dá)，以桃蚜為試蟲，進(jìn)行生物測定。結(jié)果表明，組成性表達(dá)幾丁質(zhì)酶Bmchi基因顯著提高了菌株毒力，而組成性表達(dá)缺失了結(jié)合域的Bmchi基因?qū)甓?/p>

6、力的影響并不明顯。在1×10<'7>個/mL孢子濃度下，超量表達(dá)Bmchi的轉(zhuǎn)化子對桃蚜的半致死時間(LT<,50>)比野生菌株縮短了13.4％，而超量表達(dá)Bmchi△c的轉(zhuǎn)化子的LT50比野生菌株僅縮短了5.8％。處理138hr后，致死中濃度(LC<,50>)計算結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超量表達(dá)Bmchi轉(zhuǎn)化子的LC<,50>(5.5×10<'6>個/mL)比野生菌株降低了76％，而超量表達(dá)Bmchi△c轉(zhuǎn)化子的LC<,50>比野生菌株略有增加。