重組生長激素對手術創(chuàng)傷和腹腔感染時白蛋白合成率影響的研究.pdf

1、第一部分示蹤技術測定白蛋白合成率相關方法的建立 目的： 完善白蛋白提純和水解等方法；確定苯丙氨酸在氣相色譜質譜聯(lián)用儀GC/MS下檢測條件和分析方法；建立穩(wěn)定性同位素示蹤劑測定白蛋白合成速率的方法。 方法： 1．血清白蛋白采用三氯乙酸/乙醇法提純，SDS-PAGE鑒定純度，Bradford法定量；采用HPLC法對水解液氨基酸進行定量，固相萃取法對苯丙氨酸衍生前進行處理。 2．應用MSTFA對氨基酸進

2、行衍生化，選取庚烷作為溶劑，GC自動進樣lul。 3．與譜庫進行對比，確定衍生化產物的特征片段，對質核比M+5，M+2和M+0的積分面積進行比較，確定相對豐度表達方法。 4．白蛋白合成率分數(shù)測定用標準曲線法，再根據隨時間推移白蛋白和前體池中同位素相對豐度TTR的變化，計算FSR。 結果： 對提純后血漿白蛋白進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)在66KD處有純度較高條帶；Bradford法測定白蛋白濃度為0.9mg/

3、ml；HPLC法測定水解液中氨基酸濃度為0.6umol/L；衍生化產物為化產物為N，O-雙三甲基硅炕基-L-苯丙氨酸和N，O-雙三甲基硅烷基-[2H5]-L-苯丙氨酸；選取質核比197/194作為相對豐度TTR指標：前體池中苯丙氨酸TTR在輸注實驗后1h達到平臺期，此時并入白蛋白苯丙氨酸TTR的增加成線性，基于此計算出的正常新西蘭兔在給予腸外營養(yǎng)情況下的白蛋白合成率分數(shù)為17.26±0.92(n=8)。 結論： 1．白蛋

4、白的提純和水解方法以及氨基酸衍生化方法達到測定白蛋白FSR的要求。 2．用于測定穩(wěn)定性同位素示蹤劑的GC/MS條件穩(wěn)定，分析數(shù)據方法可靠。 3．穩(wěn)定性同位素示蹤劑[2H5]-L-苯丙氦酸測定白蛋白合成率分數(shù)的方法可行，為進一步評估手術和感染等應激時白蛋白合成速率變化提供技術支持。 第二部分生長激素對手術創(chuàng)傷和腹腔感染時白蛋白合成率的影響 目的： 改良盲腸結扎穿孔的新西蘭兔模型，建立取血和營養(yǎng)輸注途

5、徑；通過已建立的穩(wěn)定性同位素示蹤技術評估腹腔感染和手術應激對動物白蛋白合成率分數(shù)的影響；評估重組人生長激素對腹腔感染持續(xù)狀態(tài)白蛋白合成代謝的作用。 方法： 1．腹腔感染模型的制作采用改良后的盲腸結扎穿孔法，腹腔感染引流術去除腹腔感染，頸外靜脈置管和彈簧固定的方法分別用于取血和營養(yǎng)液的輸注。 2．新西蘭兔隨機分為四組，即正常合成率組、假手術組、腹腔感染組和生長激素干預組；腹腔感染組和生長激素干預組在第一次同位素輸注

6、實驗結束后實施腹腔感染引流術；四組動物均給予全胃腸外營養(yǎng)支持(TPN)；分別在術前、術后第1天和第4天對一般指標(體重，血清白蛋白濃度等)進行檢測。 3．生長激素干預組于第一次輸注實驗后每晚0：00給予肌肉注射生長激素0.3u/kg，其他組給予安慰劑。 4．穩(wěn)定性同位素標記物[2H5]L-苯丙氨酸注射液經滅菌和除熱源處理，根據體重計算給藥劑量，將同位素混入腸外營養(yǎng)中經耳緣靜脈微量注射泵輸入體內。自穩(wěn)定性同位素輸注實驗開始

7、后，每小時取血3ml，直至6小時后實驗結束。 5．白蛋白合成率分數(shù)測定用標準曲線法，根據隨時間推移并入白蛋白和前體池中同位素相對豐度TTR的變化，計算FSR，并進行組內和組間比較。 結果： 本研究發(fā)現(xiàn)盲腸結扎穿孔術后1天，新西蘭兔腹腔粘連較重，腸系膜和腸管充血水腫，腹腔有膿性積液；取血和營養(yǎng)輸注方法可有效維持4天以上；對動物體重和血清白蛋白濃度的變化進行了觀察，發(fā)現(xiàn)腹腔感染組第4天體重和血清白蛋白濃度較術前顯著下

8、降(p值分別為0.037和0.001)；各組實驗動物白蛋白FSR的組內比較，發(fā)現(xiàn)生長激素組FSR第4天顯著高于第1天(p=0.006)；四組實驗動物自蛋白FSR的組間比較，發(fā)現(xiàn)第1天四組間FSR有差異(F=33.687，p＜0.001)，其中假手術組、腹腔感染組和生長激素組的FSR均較正常組高(p＜0.05)；腹腔感染組和生長激素組較假手術組高(p＜0.001)；第4天四組間FSR差異顯著(F=65.794，p＜0.001)，腹腔感染組

9、高于正常組(p=0.001)和假手術組(p=0.002)；生長激素組則高于其他三組(p＜0.001)。 結論： 1．改良后的盲腸結扎穿孔術可有效的形成腹腔感染，取血和輸注裝置的改良可以滿足實驗需要。 2．手術和腹腔感染應激早期白蛋白合成率加快，兩者的疊加效應可將白蛋白合成與分解代謝率推向更高的水平。 3．手術和腹腔感染應激持續(xù)期白蛋白合成率仍處于高水平，但由于分解速率處于更高水平，機體不能維持此時血清白蛋