重組生長激素對肝移植術后早期膽汁淤積和肝臟功能影響的實驗研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分 大鼠原位肝臟移植模型的建立 目的: 探討大鼠原位肝移植(OLT)模型的建立方法,為肝移植的相關研究提供穩(wěn)定的模型基礎。 方法: 通過改良的Kamada“二袖套法”,對Wistar大鼠實施了同種原位肝移植手術,并觀察大鼠術后存活率和并發(fā)癥的發(fā)生情況。 結果: 總共實行大鼠原位肝臟移植近220例,在40例定型手術中,供體手術時間(22.3±7)min,全肝

2、移植組供肝修整時間(15.6±4)min,受體手術時間(50.6±11.2)min,無肝期為(20.6±2.5)min,手術成功率為100％,一周存活率為92.5％。成功地建立了穩(wěn)定的大鼠肝移植模型。 結論: 大鼠原位肝移植模型的建立,需要一定的顯微外科基礎和熟悉大鼠的腹部解剖結構的前提下,經過一段時間的專門訓練,方能獲得成功。其中嫻熟的顯微外科技術和耐心細致地手術操作是大鼠原位肝移植成功的關鍵。 第二部分 重

3、組生長激素對大鼠肝移植術后早期膽汁淤積和肝臟功能的影響 目的:探討重組生長激素(rhGH)對肝移植術后早期膽汁淤積和肝功能恢復的影響。 方法:采用Kamada的雙袖套法并加以改進,建立Wistar大鼠原位肝移植模型。按隨機原則將大鼠分三組：假手術組(SO組)、肝移植組(OLT組)、肝移植術后生長激素干預組(OLT+rhGH組)。每組按術后1d、3d、7d三個時相點再分成三個亞組,每一時相點6只大鼠,于預定時相點處死分別留

4、取血清及肝臟組織標本,測定血清ALP、GGT、ALT、TBIL水平評估肝功能；酶聯(lián)免疫法檢測血清TNFα、IL-1β水平；放射免疫法測定血清生長激素(GH)水平；放射配體結合分析法分析移植肝生長激素受體(GHR)和胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)表達；高效液相色譜法(HPLC)檢測肝組織ATP含量；用化學比色法測量肝臟中Na+/K+ATP酶等的濃度變化；免疫熒光染色半定量分析Mrp2的定位；RT-PCR法檢測肝組織Mrp2mRN

5、A表達；并將Mrp2mRNA與血清TBIL、TNFα作相關分析；常規(guī)病理結合電鏡分別觀察肝臟組織學及超微結構的改變。 結果: 1.OLT+rhGH組血清ALT、ALP、TBIL、GGT、TNFα低于OLT組,差異均具有顯著性意義(P<0.05)。OLT+rhGH組血清IL-1β與OLT組比較無差別。 2.在肝移植術后1d組和3d組,ATP含量和Na+/K+ATPase活性均有明顯下降,至術后7d組各指標和SO組比

6、較無差別。GH處理后各指標水平均較OLT組明顯上升,差異具有顯著性意義(P<0.05)。 3.OLT+rhGH組GH水平在術后1天,和SO、OLT組差別無統(tǒng)計學意義,而在術后3、7d組明顯高于OLT組同時相點水平(P<0.05),和SO組比較差別無統(tǒng)計學意義。大鼠肝移植術后GH-IGF-1軸發(fā)生改變,術后7d內GHR和IGF-1R表達呈下降趨勢。rhGH治療組術后7d GHR數(shù)恢復明顯,術后3、7d IGF-1R數(shù)恢復明顯(P<

7、0.05)。 4.Mrp2轉運蛋白特異性定位于肝細胞膜的毛細膽管面,熒光染色呈線條形勾勒出毛細膽管輪廓,給予rhGH的肝移植大鼠肝臟Mrp2表達水平明顯增高,恢復加快。Mrp2的RT-PCR結果表明：其表達于術后3d達高峰。OLT術后Mrp2表達亦明顯下調,給予rhGH的肝移植大鼠肝臟Mrp2RNA表達明顯上調,水平明顯增高,恢復加快。肝組織Mrp2基因的表達與血清TBIL、TNFα存在密切的負相關(P<0.05)。 5

8、.肝組織常規(guī)HE染色和電鏡檢查均提示：重組生長激素干預的肝移植組的肝細胞損傷改變較未干預組輕。 結論: 1.大鼠肝移植術后早期存在膽汁淤積。肝細胞功能恢復早于其形態(tài)學恢復。肝移植術后應用外源性GH對大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷具有保護作用可促進熱缺血損傷移植肝功能恢復。 2.肝移植術后肝組織的能量代謝有顯著改變。在術后肝組織ATP含量和肝細胞胞質膜Na+/K+ATP酶活性均顯著降低,這表明此時膽汁淤積的發(fā)生有泵功能顯

9、著不足的因素參與作用。肝組織的泵功能不足是導致大鼠肝移植術后并發(fā)膽汁淤積的因素之-。 3.大鼠原位肝移植后產生一過性GH抵抗,存在GH相對不足；熱缺血損傷移植肝GH-IGF-1軸的改變與熱缺血損傷移植肝恢復延遲有關；肝移植術后應用外源性GH可促進移植肝GH-IGF-1軸的恢復,并促進肝功能的恢復。 4.Mrp2表達的減少以及定位的異常是鼠肝移植術后膽汁淤積發(fā)生的主要分子機制之一,rhGH促進膽紅素的轉運的作用機制可能是通