DcR3對肝移植術后肝臟保護作用的實驗研究.pdf

1、DcR3是一個新發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的分子，屬于腫瘤壞死因子受體超家族的成員。其ORF編碼300個氨基酸，其中包括由29個氨基酸殘基組成的信號肽，但沒有跨膜區(qū)，是一個分泌性的蛋白。主要在胃、脊髓、結腸、淋巴結、脾臟、內(nèi)皮細胞以及肺和結腸來源的腫瘤細胞表達。DcR3的配體包括FasL、LIGHT和TL1A，均是TNF家族成員。 最近的研究表明DcR3能抑制FasL和IFN-γ所致的胰島細胞凋亡、胰島素釋放受損，提高胰島移植成功率

2、及延長其生存時間。有研究證實于心臟移植前一天開始連續(xù)7天靜脈注射DcR3蛋白，小鼠心臟存活時間比對照組延長3.3天。其研究結果強烈提示DcR3的免疫抑制效應可能在控制移植排斥反應中有一定的作用。 DcR3主要通過與Fas競爭性結合FasL而阻斷FasL所誘導的細胞凋亡，還通過調(diào)節(jié)T細胞與APC的相互作用，調(diào)節(jié)巨噬細胞及樹突狀細胞的分化與激活，抑制免疫反應中T細胞擴增和CXCL12/SDF-1α、FasL對T細胞的趨化作用，產(chǎn)生免

3、疫抑制效應。與肝移植聯(lián)系起來考慮，DcR3可能通過抑制CXCL12/SDF-1α及FasL對T細胞的趨化作用、阻斷CTL細胞通過Fas/FasL途徑對肝臟的攻擊而發(fā)揮死亡誘騙受體的作用。但是靜脈注射DcR3蛋白不能將其免疫抑制作用局限于肝臟之中，全身性的副作用較大。因此我們有理由推測：若能通過轉基因技術將DcR3表達在移植肝中，將可能有助于將其免疫抑制作用局限在肝臟之中，抑制宿主CTL細胞對移植肝的攻擊。 AAV基因組可定點整合

4、至宿主染色體，既可避免隨機整合可能出現(xiàn)的插入性突變，又能保證目的基因的長期穩(wěn)定表達。因此在誘導肝移植耐受時，AAV可作為免疫調(diào)節(jié)或移植物保護分子轉染的理想載體。由于DcR3蛋白的代謝迅速，半衰期僅有20分鐘左右，因此將AAV作為載體轉染移植肝，可望實現(xiàn)DcR3蛋白在移植肝的長期表達，從而對移植肝產(chǎn)生保護作用，同時避免靜脈注射DcR3蛋白所致的全身性副作用。 基于以上分析，我們設想用重組DcR3/AAV感染供肝，將DcR3表達于供

5、肝組織中，利用其免疫抑制效應，抑制宿主CTL細胞對移植肝的攻擊，從而延長移植肝的存活時間。我們先進行DcR3基因克隆、重組質粒構建及表達鑒定；然后進行重組DcR3/AAV的組裝及鑒定；最后以近交系大鼠肝移植模型為基礎，研究DcR3基因轉染對移植術后肝臟的保護作用。通過這些研究，闡明DcR3基因在肝臟的表達在保護移植肝免受排斥反應損傷中的作用，探討防止急性排斥反應和延長移植肝存活時間的新手段。本文的主要研究內(nèi)容及結果包括： 1.采

6、用PCR技術克隆DcR3cDNA編碼序列，構建真核表達載體。檢測了重組DcR3/pAAV-IRES-hrGFP質粒在真核細胞中的表達，結果DcR3蛋白的表達正確。DcR3真核表達載體的構建成功為重組DcR3/AAV的包裝奠定了良好的基礎。我們進一步用激光共聚焦顯微技術成功檢測到重組DcR3/pAAV-IRES-hrGFP質粒在真核細胞中的表達，并證明質粒中GFP與DcR3在真核細胞中的表達具有一致性，提示可以將重組質粒轉染的真核細胞中G

7、FP的表達作為DcR3表達的標志。 2.通過優(yōu)化AAV-293細胞的轉染條件，成功在AAV-293細胞中包裝出重組DcR3/AAV并進行純化及純度、滴度測定，獲得了高純度、高滴度的重組DcR3/AAV。我們還用純化的重組DcR3/AAV感染真核細胞，檢測其攜帶的DcR3基因在真核細胞中的表達情況，結果純化的重組DcR3/AAV感染真核細胞后，其攜帶的DcR3基因可在真核細胞中正常地表達。 3.以近交系大鼠肝移植模型為基礎

8、，將重組DcR3/AAV感染移植肝，通過觀察大鼠的生存情況、檢測肝臟功能、觀察DcR3在肝臟的表達及肝臟病理改變，發(fā)現(xiàn)肝外器官中沒有轉染的DcR3基因表達；DcR3在肝臟組織中的表達與G4組大鼠生存時間延長、肝功能變化、肝臟組織中淋巴細胞浸潤時間滯后、數(shù)量減少及肝組織的破壞程度減輕相關。 綜上，本研究證實轉染的DcR3基因僅在移植肝中表達；DcR3在肝臟組織中的表達能明顯延長大鼠生存時間、減輕肝功能損害、抑制移植肝臟組織中淋巴細