Omega-3脂肪酸對大鼠冷保存供肝肝移植后肝損傷保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　供肝的冷保存缺血再灌注損傷以及由此引發(fā)一系列問題諸如移植后早期肝功能不良、原發(fā)移植肝無功能、膽道并發(fā)癥等一直是肝移植研究的熱點問題。目前，缺血再灌注損傷的機制仍不十分清楚，一致觀點是供肝復(fù)流后會激活天然免疫系統(tǒng)并由此引發(fā)的局灶性促炎反應(yīng)。供肝冷保存缺血性損害主要表現(xiàn)為局限性代謝紊亂、實質(zhì)細(xì)胞死亡，并由此引發(fā)配體激活、線粒體氧自由基釋放。復(fù)流后，上述不良因素會在Kupffer細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和中性粒

2、細(xì)胞等多種非實質(zhì)細(xì)胞參與下激活宿主天然免疫系統(tǒng)，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。外周血中免疫細(xì)胞的加入會使這一免疫激活-炎癥級聯(lián)反應(yīng)持續(xù)進(jìn)展。簡而言之，冷保存造成的缺血再灌注損傷是宿主天然免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的局限性促炎反應(yīng)，最終造成肝臟實質(zhì)細(xì)胞的損害。
　　既往研究證實，omega-3多不飽和脂肪酸（以下簡稱omega-3脂肪酸）能改善胃腸外營養(yǎng)相關(guān)性肝病預(yù)后;減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、降低黏附分子的表達(dá)，從而起到直接或間接抗炎的作用;預(yù)防脂肪肝小鼠缺血再

3、灌注損傷和微循環(huán)衰竭的作用;減輕小鼠化學(xué)性肝損傷和梗阻性黃疸肝細(xì)胞損傷的作用。新近研究證實，omega-3脂肪酸還具有改善大鼠缺血再灌注損傷，促進(jìn)肝切除后肝再生的作用。
　　雖然最近有omega-3脂肪酸能改善肝移植患者術(shù)后肝損傷的臨床報道，但其確切作用機制還不十分清楚。眾所周知，即使在醫(yī)學(xué)迅猛發(fā)展的今天，肝移植過程中冷保存缺血再灌注損傷仍不可避免。因而如何緩解冷保存缺血再灌注損傷，對于改善肝移植患者肝功能、提高手術(shù)效果具有非常重

4、要的意義。缺血再灌注損傷時宿主天然免疫系統(tǒng)激活，肝臟非實質(zhì)細(xì)胞釋放的各種炎癥介質(zhì)對于免疫激活-炎癥級聯(lián)反應(yīng)的維持非常關(guān)鍵。目前已明確omega-3脂肪酸能在轉(zhuǎn)基因小鼠化學(xué)性肝炎模型中起到抗炎作用。因此，我們設(shè)想，首先通過Kamada“二袖套法”建立基于精準(zhǔn)外科理念下的不重建肝動脈的大鼠原位肝移植模型，找出靜脈和膽管最合適的重建方法。并在此基礎(chǔ)上建立重建肝動脈的冷保存大鼠原位肝移植模型，探究不同冷保存時間對移植術(shù)后近期肝功能和微循環(huán)的影響

5、，找出動物實驗研究合適的冷保存時間長度。最后對重建肝動脈冷保存肝移植大鼠行術(shù)后omega-3脂肪酸干預(yù)，以明確omega-3脂肪酸是否對冷保存缺血再灌注后的供肝具有保護(hù)作用。
　　第一部分：基于精準(zhǔn)外科理念的大鼠肝移植模型的建立和評價
　　目的:基于精準(zhǔn)外科理念下，建立不重建肝動脈血供的成熟穩(wěn)定的同品系大鼠原位肝移植模型。并對肝移植模型進(jìn)行評價，探索二袖套法肝移植中最佳的肝上腔靜脈顯微縫合方法，最佳的靜脈吻合用袖套管和膽管吻

6、合支架管。
　　方法:健康成年雄性SD大鼠，體重250-300g。供受體體重相差≤20g。根據(jù)不同的顯微縫合方法、袖套和支架類型，將移植組大鼠隨機分為3組。第1組:新的肝上腔靜脈顯微縫合方法+單槽袖套+無損傷膽管支架;第2組:新的肝上腔靜脈顯微縫合方法+單槽袖套+粗制膽管支架;第3組:肝上腔靜脈采用傳統(tǒng)的雙定點連續(xù)縫合法+多槽袖套+無損傷膽管支架。第4組為對照組，實施假手術(shù)，僅開腹游離肝周韌帶和移植相關(guān)血管。記錄移植組大鼠各個操作

7、步驟時長、一周和一月的生存率。1月后全部大鼠均在乙醚麻醉下處死，測定其血液肝功能生化指標(biāo)，并詳細(xì)解剖肝上、肝下腔靜脈、門靜脈和肝門部膽管，以明確有無血管扭轉(zhuǎn)、血栓形成和膽汁瘤、膽道梗阻等并發(fā)癥。P＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。所有的統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用PASW18.0來分析。
　　結(jié)果:新的肝上腔靜脈顯微縫合方法較傳統(tǒng)的雙定點連續(xù)縫合法速度更快(P＜0.05)，無術(shù)后肝上腔靜脈吻合口出血的發(fā)生。單槽袖套明顯縮短肝下腔靜脈和門靜脈的重建時間(

8、P＜0.05)，同時術(shù)后血栓也明顯減少。新的肝上腔靜脈顯微縫合方法結(jié)合單槽袖套較傳統(tǒng)連續(xù)縫合與多槽袖套能明顯縮短無肝期(P＜0.05)。1月后移植組大鼠的肝功能各項指標(biāo)已恢復(fù)正常，與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。新的膽管支架制作方法能夠明顯降低大鼠肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生，進(jìn)而提高了大鼠的一周和一月存活率(P＜0.05)。
　　結(jié)論:新的肝上腔靜脈顯微縫合方法結(jié)合重新設(shè)計制作的單槽袖套較傳統(tǒng)縫合方法和袖套能夠以較小創(chuàng)傷，

9、更簡單、迅速、可靠地吻合肝上、肝下腔靜脈和門靜脈，顯著地縮短無肝期，更符合精準(zhǔn)外科“最小侵襲，最大臟器保護(hù)”的理念。同時，無損傷膽管支架明顯較傳統(tǒng)粗制支架減弱了對膽管內(nèi)壁的損傷。因而顯著地降低了移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生。簡言之，基于精準(zhǔn)外科理念的大鼠肝移植模型創(chuàng)傷更小，耗時更短，模型更穩(wěn)定、可靠，并發(fā)癥更少，能夠獲得更好的遠(yuǎn)期生存。
　　第二部分：冷保存對大鼠肝移植術(shù)后肝功能和即時微循環(huán)的影響
　　目的:建立成熟穩(wěn)定、重建肝

10、動脈血供的大鼠冷保存肝移植模型。探討不同冷保存時間對大鼠肝移植術(shù)后肝功能和即時微循環(huán)的影響，為進(jìn)行冷保存肝移植后肝損傷的藥物治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:實驗動物同第一部分。采用第一部分的手術(shù)方法建立恢復(fù)肝動脈血供的冷保存大鼠原位肝移植模型。根據(jù)不同的冷保存時間，將大鼠隨機分為3組:第1組，冷保存12h齟:供肝使用4℃HTK液灌注并冷保存12h;第2組，冷保存24h組:供肝使用4℃HTK液灌注并冷保存24h;第3組:正常對照組，實

11、施假手術(shù)，僅開腹游離肝周韌帶和移植相關(guān)血管。記錄無肝期和供、受體所用手術(shù)時間和術(shù)后7天受體的一般情況。移植組供肝復(fù)流后3、10、20min、對照組完成游離操作后3min分別使用激光散斑灌注成像法對肝臟表面微循環(huán)進(jìn)行測定。移植組大鼠各取10只受體進(jìn)行7天生存率的比較，其余受體分別于術(shù)后1天(24h)、3天、7天處死取血和肝組織標(biāo)本，每一時間點取6只受體。對照組6只正常大鼠于術(shù)后7天處死取血。移植組和對照組檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine

12、aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase，AST)、，白蛋白(albumin,Alb)、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）和總膽紅素(totalbilirubin，TB)等肝功能指標(biāo)。肝組織行HE染色，分別從門管區(qū)炎細(xì)胞浸潤、局灶性壞死、膽管增殖、膽管損傷和間質(zhì)纖維化等5方面對肝損傷程度進(jìn)行半定量評分。所有大鼠在處死前均經(jīng)腹壁行肝臟中葉的超聲實時

13、彈性成像。所有數(shù)據(jù)使用PASW18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.手術(shù)時間及術(shù)后一般情況:兩冷保存移植組大鼠的供、受體手術(shù)操作時間無明顯差別(P＞0.05)，無肝期均控制在14min以內(nèi)。冷保存12h組受體術(shù)后恢復(fù)較快，麻醉清醒后即刻活動，進(jìn)飲食水。兩組存活受體均未見鞏膜、雙耳、爪子和尿液的黃染。
　　2.供肝復(fù)流后肝臟表面微循環(huán)變化:冷保存肝移植大鼠的肝臟表面微循環(huán)流量值明顯

14、低于正常對照組(P＜0.05)。冷保存12h組肝臟表面微循環(huán)流量值明顯高于冷保存24h組(P＜0.05)。
　　3.生存率:冷保存12h組明顯高于冷保存24h組(P＜0.05)。
　　4.血清肝功能指標(biāo)變化情況:在術(shù)后1、3、7天，兩冷保存肝移植組大鼠肝功能受損嚴(yán)重，各項指標(biāo)均明顯差于對照組(P＜0.05)，且同時間點冷保存24h組明顯差于冷保存12h組(P＜0.05)。隨時間延續(xù)，兩冷保存組ALT、AST呈逐漸下降趨勢，A

15、LP則呈先降低后升高，Alb和TB均呈逐漸增高趨勢。
　　5.肝組織HE染色半定量評分:冷保存肝移植術(shù)后1天肝損傷已非常明顯:肝細(xì)胞腫脹，近中央靜脈的肝細(xì)胞空泡變性嚴(yán)重，肝血竇擴張充血，門管區(qū)炎細(xì)胞浸潤，膽管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、壞死。隨時間延續(xù)，肝細(xì)胞腫脹、肝血竇擴張有所減輕，空泡變逐漸緩解，門管區(qū)炎細(xì)胞浸潤和膽管增生較前明顯，局灶性壞死有所減輕，膽管損傷有加重趨勢，間質(zhì)纖維化改變不明顯。同時間點，冷保存12h組在門管區(qū)炎細(xì)胞浸潤、膽管

16、損傷和局灶性壞死等方面的評分均低于冷保存24h組(P＜0.05)，冷保存12h組的膽管增殖評分則在術(shù)后3天和一周低于冷保存24h組(P＜0.05);兩組間在間質(zhì)纖維化上評分差別不顯著(P＞0.05)。
　　6.超聲實時彈性成像:以對照組的肝臟彈性模量值為正常參考值，冷保存肝移植組在術(shù)后第1天肝臟彈性模量值即高于正常值(P＜0.05)，但隨時間延續(xù)，各組的肝臟彈性模量值變化不大(P＞0.05)。冷保存24h組肝臟彈性模量值與冷保存1

17、2h組差別不明顯(P＞0.05)，但兩冷保存組肝臟彈性模量值始終高于正常值(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.供肝冷保存會造成肝移植大鼠肝功能的嚴(yán)重?fù)p害，且對于膽管細(xì)胞的損傷要重于肝細(xì)胞。隨著冷保存時間的延長，這種肝功能損害隨之加重。
　　2.供肝冷保存會造成術(shù)后早期的肝臟微循環(huán)障礙，隨著供肝冷保存時間延長，微循環(huán)損害加重。激光散斑灌注成像可以作為供肝冷保存缺血損傷嚴(yán)重程度的早期評價指標(biāo)之一。
　　3.供肝冷

18、保存12h的大鼠原位肝移植是作為研究冷保存肝移植后肝損傷的比較合適的動物模型。
　　4.超聲實時彈性成像可以作為安全、無創(chuàng)地評價肝臟功能的一個參考指標(biāo)。
　　第三部分：Omega-3脂肪酸對大鼠冷保存供肝肝移植術(shù)后肝功能的影響
　　目的:明確omega-3脂肪酸對大鼠冷保存肝移植術(shù)后肝功能影響并對其作用機制作初步探討。
　　方法:實驗動物及手術(shù)方法同第二部分。根據(jù)供肝有無冷保存以及術(shù)后不同處理，將大鼠隨機分為3組

19、:其中第1組實施正常肝移植，第2、3組實施供肝冷保存12h肝移植。術(shù)后1-7天，第1、2組予每天生理鹽水12ml/kg灌胃，第3組予每天omega-3魚油脂肪乳12ml/kg灌胃。每組取10只受體進(jìn)行4周生存率的比較。分別于術(shù)后3天、1周、2周、3周和4周處死受體，每一時間點取6只受體，取血和肝組織標(biāo)本。血清肝功能指標(biāo)檢測和肝組織HE染色半定量評分方法同第二部分。術(shù)后各時間點，免疫組織化學(xué)方法檢測肝組織中Ki-67的表達(dá)，Masson染

20、色方法描述肝組織中纖維組織增生的程度。所有受體處死前經(jīng)腹壁行肝臟超聲實時彈性成像，方法同第二部分。另外，對術(shù)后3天、1周、2周標(biāo)本分別使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清、實時熒光定量PCR技術(shù)檢測肝組織中TNF-alpha,IL-6，IFN-gamma和TGF-beta(1)的表達(dá)情況。所有數(shù)據(jù)使用PASW18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.生存率:正常肝移植組大鼠術(shù)后4周生存率高于冷保存

21、組(P＜0.05)，兩冷保存組間生存率無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.血清肝功能指標(biāo):術(shù)后2周內(nèi)，第2組術(shù)后肝功能指標(biāo)除Alb外明顯差于第1、3組(P＜0.05)，第3組雖較第2組有所改善但仍未達(dá)第1組水平(P＜0.05)。各組術(shù)后2-3周肝功能指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，并在3-4周趨于平緩。4周觀察期末，第1、3肝功能基本恢復(fù)，但第2組肝功能指標(biāo)仍未達(dá)正常值(P＜0.05)。
　　3.肝組織HE染色半定量評分:同時間點，各組局灶

22、性壞死和間質(zhì)纖維化評分無差別。膽管損傷則第1組最弱，余兩組無明顯差別。門管區(qū)炎細(xì)胞浸潤第2組最強，其余兩組無明顯差別。膽管增殖:術(shù)后第1、2周，第1組最弱，其余兩組無顯著差別;術(shù)后第3周第2組最強，其余兩組無明顯差別。
　　4.肝臟超聲實時彈性成像:各組肝臟彈性模量值總體呈逐漸降低趨勢，兩冷保存組相同時間點無明顯差別(P＞0.05)，但均較正常移植組為高(P＜0.05)。
　　5.血清細(xì)胞因子水平:各組大鼠血清中TNF-al

23、pha、IFN-gamma、IL-6和TGF-beta1均呈先升后降趨勢，術(shù)后1周為峰值。相同時間點，第2組術(shù)后血清中TNF-alpha、IFN-gamma、IL-6水平最高(P＜0.05)，第1、3組間無明顯差別(P＞0.05)。而同時間點各組間TGF-beta(1)無明顯差別(P＞0.05)。
　　6.肝組織細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況:肝組織中TNF-alpha，IFN-gamma，IL-6和TGF-beta1的mRNA表達(dá)強度

24、與血清中的變化趨勢類似。相同時間點上，TNF-alpha、IFN-gamma和IL-6各細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)，第2組明顯高于其余兩組(P＜0.05)，且1、3組間則無明顯差別(P＞0.05)，TGF-beta1則在各組間無明顯差別(P＞0.05)。
　　7.肝細(xì)胞增殖情況:肝組織Ki-67結(jié)果顯示，各組術(shù)后肝細(xì)胞均有不同程度增殖，1周內(nèi)增殖活躍，其后逐漸減弱。第1、3組間肝細(xì)胞增殖程度無明顯差別(P＞0.05)。前2周內(nèi)，第2組

25、肝細(xì)胞增殖程度明顯強于第1、3組(P＜0.05);第3周，第2組肝細(xì)胞增殖程度仍強于第3組(P＜0.05)，第4周各組間差別不顯著(P＞0.05)。
　　8.肝組織中膠原纖維的檢測:Masson染色評分顯示，各組術(shù)后肝組織中膠原纖維含量呈先升后降趨勢，以第2、3周為高。相同時間點，各組膠原纖維含量無差別(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.與正常移植相比，供肝冷保存12h會顯著降低肝移植大鼠術(shù)后4周生存率，給予ome

26、ga-3脂肪酸并不能提高其4周生存率。
　　2.供肝冷保存12h肝移植后給予omega-3脂肪酸能在一定程度上改善術(shù)后肝功能生化指標(biāo)，但不能改變其恢復(fù)的進(jìn)程。
　　3.Omega-3脂肪酸通過降低肝組織和血清中TNF-alpha、IFN-gamma和IL-6等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)從而起到抑制炎癥反應(yīng)，緩解缺血再灌注損傷，改善肝功能的作用。Omega-3脂肪酸的使用不增加肝臟纖維化的風(fēng)險，但對于改善冷保存造成的膽管損傷和膽管增殖