甲烷通過保護(hù)線粒體功能減輕DCD大鼠供肝冷保存-再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　肝移植是多種終末期肝病唯一有效的治療方法，但是隨著肝病患者數(shù)量的不斷增加，移植等待名單上患者數(shù)量也在不斷的增長(zhǎng)，同時(shí)供體肝臟的數(shù)量短缺，供受體間的矛盾日益突出。在中國(guó)的法律法規(guī)下，心臟死亡供體(DCD)成為供體肝臟主體的趨勢(shì)越來越明顯。DCD供體肝臟在移植過程中經(jīng)歷了熱缺血、冷保存和再灌注三個(gè)階段。DCD供肝較傳統(tǒng)途徑獲取的供體肝臟有著明顯的差別，這類供體肝臟經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的熱缺血過程，且熱缺血時(shí)間難以控制，術(shù)后供體肝臟

2、功能恢復(fù)緩慢甚至移植肝失功的發(fā)生率大大增加。隨后的冷保存和再灌注過程人為可控，同時(shí)也是損傷的關(guān)鍵，對(duì)器官功能有著重要的影響。冷保存階段細(xì)胞功能衰竭、能量供給障礙都會(huì)降低器官功能，并對(duì)下一步的再灌注產(chǎn)生極大的影響。再灌注階段的損傷機(jī)制復(fù)雜，主要有氧自由基損傷、鈣超載、中性粒細(xì)胞集聚損傷、炎性因子、線粒體失功等，各種損傷因素之間相互聯(lián)系相互影響。近年來，隨著在亞細(xì)胞層面上對(duì)冷保存-再灌注損傷機(jī)制的研究，細(xì)胞器線粒體在損傷中所起的作用越來越受

3、到重視。線粒體是氧化磷酸化和能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，線粒體失功能夠?qū)浔４婧驮俟嘧㈦A段都產(chǎn)生不利的影響。冷保存階段的線粒體功能損害會(huì)引起肝臟細(xì)胞能量合成障礙，加重細(xì)胞水腫和凋亡;而再灌注時(shí)失功的線粒體會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，損害嚴(yán)重的線粒體再灌注后功能將難以恢復(fù)，另外，損傷線粒體可在再灌注初期產(chǎn)生少量ROS并進(jìn)一步引發(fā)灌注后期ROS的爆發(fā)產(chǎn)生。
　　器官保存液的發(fā)明對(duì)器官移植技術(shù)的發(fā)展提供了巨大的推動(dòng)作用，而其發(fā)揮作用的階段主要在冷保

4、存階段，通過保護(hù)冷保存階段細(xì)胞的功能，減少細(xì)胞腫脹壞死和能量耗竭等，并進(jìn)一步減輕再灌注過程中的損傷因素，最終減輕移植器官失功。UW液一直是器官保存的“金標(biāo)準(zhǔn)”，隨著對(duì)器官保存機(jī)制的研究和認(rèn)識(shí)的深入，人們通過改變UW液的成分來達(dá)到進(jìn)一步提高保存效率的目的，并取得了良好的效果。對(duì)器官保存液中有效成分進(jìn)一步改進(jìn)，從而使之對(duì)供體器官起到更有效的保護(hù)作用，成為近年來器官移植研究領(lǐng)域一大熱點(diǎn)問題。
　　甲烷(Methane)是一種無色、無味、

5、可燃性氣體。是一種單純性的窒息性氣體，但是本身并沒有毒性。甲烷在大氣中含量豐富，由于其具有可燃性，常常被用作燃料。隨著對(duì)甲烷理化性質(zhì)研究的深入，人們慢慢認(rèn)識(shí)到它在醫(yī)療領(lǐng)域的價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，甲烷能夠加強(qiáng)小腸蠕動(dòng)幅度，增加小腸收縮能力。Boros證實(shí)甲烷能夠減輕腸道的缺血再灌注損傷，而這一作用是通過其具有的抗氧化、抗炎作用實(shí)現(xiàn)的。在另外一項(xiàng)研究中，通過富含甲烷的生理鹽水注射到大鼠體內(nèi)以減輕大鼠肝臟的缺血再灌注損傷。甲烷本身具有良好的還原性，

6、在機(jī)體的氧化還原平衡中，甲烷也具有重要的作用，研究證實(shí)，在乏氧的情況下，線粒體能夠產(chǎn)生甲烷對(duì)抗過剩的過氧化物以減輕過氧化物對(duì)線粒體的損傷。同時(shí)有明確的研究顯示吸入甲烷能夠減輕再灌注過程中線粒體電子傳遞鏈的損傷，這表明甲烷對(duì)線粒體有重要的保護(hù)作用。我們假想，能否在冷保存階段加入甲烷，減輕冷保存階段的線粒體損傷，并進(jìn)一步減輕再灌注損傷。本課題采用SD大鼠肝臟移植模型，研究在冷保存和再灌注兩個(gè)過程中，甲烷對(duì)供體肝臟損傷及線粒體功能的影響，揭示

7、甲烷在冷保存-再灌注過程中的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分 甲烷對(duì)冷保存階段DCD供體肝臟線粒體功能的影響
　　1、冷保存階段甲烷對(duì)肝臟HE染色結(jié)果的影響;
　　我們通過人為模擬的DCD供體肝臟模型，將DCD供體肝臟冷保存4小時(shí)后，進(jìn)行HE染色，觀察DCD供體肝臟形態(tài)學(xué)變化。可以明顯觀察到添加了甲烷的UW液保存后的DCD供體肝臟細(xì)胞損傷和形態(tài)學(xué)改變均較普通UW保存的肝臟明顯減輕。
　　2、冷保

8、存階段甲烷對(duì)線粒體呼吸控制率(RCR)和線粒體磷氧比(ADP/O)的影響;
　　我們將經(jīng)歷了冷保存的DCD肝臟通過差速離心的方法提純肝臟細(xì)胞內(nèi)線粒體，并使用Clark氧化電極檢測(cè)經(jīng)保存后的線粒體RCR及相應(yīng)的ADP/O，發(fā)現(xiàn)經(jīng)富含甲烷的UW液保存處理后線粒體的功能相對(duì)于普通UW液保存處理的肝臟線粒體顯著提高。
　　3、冷保存階段甲烷對(duì)線粒體產(chǎn)生ATP功能的影響;
　　為了進(jìn)一步了解冷保存后各組線粒體功能的差別，我們使用

9、ELISA試劑盒檢測(cè)肝臟組織內(nèi)的ATP水平。結(jié)果顯示含甲烷的UW液保存組的肝臟組織ATP含量高于普通UW液組。
　　第二部分 甲烷對(duì)再灌注階段DCD供體肝臟線粒體及肝臟損傷的影響
　　1、再灌注階段甲烷對(duì)DCD供體肝臟形態(tài)學(xué)改變的影響;
　　經(jīng)歷過冷保存階段的肝臟行移植后將立即進(jìn)入再灌注階段，為了驗(yàn)證含有甲烷的UW液保存后的DCD肝臟是否能夠更好的耐受再灌注損傷，我們通過HE染色首先觀察肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的差異?？梢钥?/p>

10、出，經(jīng)過含甲烷的UW液冷保存4小時(shí)后的DCD供體肝臟在血流復(fù)灌6小時(shí)后，肝臟細(xì)胞的損傷較移植前顯著加重，但是相比較于經(jīng)過同樣處理的普通UW液保存的肝臟細(xì)胞損傷卻明顯減輕。
　　2、再灌注階段甲烷對(duì)DCD供體肝臟細(xì)胞凋亡的影響;
　　我們通過TUNEL染色的方法檢測(cè)了移植肝臟再灌注后各組肝臟細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)含甲烷的UW液組的DCD供體保存組肝臟凋亡細(xì)胞比例較普通UW液保存組顯著降低。
　　3、再灌注階段甲烷對(duì)DCD供

11、體肝臟功能指標(biāo)ALT/AST的影響;
　　為了進(jìn)一步了解各組肝臟在復(fù)灌再灌注后的損傷情況，我們通過生化分析儀檢測(cè)肝臟損傷指標(biāo)ALT和AST的水平。通過研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過甲烷保存處理的DCD肝臟損傷指標(biāo)顯著降低。
　　4、再灌注階段甲烷對(duì)DCD供體肝臟純化線粒體呼吸控制率(RCR)及磷氧比(ADP/O)的影響;
　　我們之前的研究已經(jīng)簡(jiǎn)單說明了在冷保存階段甲烷能夠減輕線粒體功能的損傷，為了進(jìn)一步了解再灌注過程中線粒體功能損傷

12、和氧化應(yīng)激的情況，我們通過Clark氧化電極法檢測(cè)了各組DCD肝臟線粒體功能指標(biāo)RCR和ADP/O。這里我們觀察到經(jīng)過含甲烷的UW液保存處理的DCD肝臟線粒體功能損傷較普通UW液組線粒體功能損傷減輕。
　　5、再灌注階段甲烷對(duì)DCD供體肝臟線粒體產(chǎn)生ATP的影響;
　　線粒體的主要功能是為氧化磷酸化提供場(chǎng)所，同時(shí)產(chǎn)生ATP，為了進(jìn)一步明確各組線粒體功能的差別，我們通過ELISA試劑盒檢測(cè)了再灌注6小時(shí)后的供肝肝臟組織ATP水

13、平，結(jié)果顯示含甲烷的UW液保存的DCD肝臟內(nèi)ATP水平相比于普通UW液組高。
　　6、再灌注階段甲烷對(duì)DCD供體肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)(MDA、SOD、ROS、GSH)的影響。
　　相關(guān)研究顯示甲烷具有良好的抗氧化作用，根據(jù)我們的假想，甲烷能夠發(fā)揮抗氧化作用是通過減輕線粒體在冷保存和再灌注過程中的損傷，從而引起氧化應(yīng)激減輕。我們通過相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了再灌注后肝臟氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)(MDA、SOD、ROS、GSH)。結(jié)果顯示，使

14、用含甲烷的UW液保存后的DCD肝臟經(jīng)歷再灌注損傷后，相關(guān)的氧化應(yīng)激指標(biāo)均有效減少，這和線粒體功能指標(biāo)的變化一致。
　　7、甲烷對(duì)移植后大鼠生存率和生存時(shí)間的影響;
　　通過改良UW成分的最終目的是要優(yōu)化供體肝臟質(zhì)量。我們通過建立大鼠肝移植模型以觀察各組肝臟在體情況下功能恢復(fù)的情況。結(jié)果顯示使用了含甲烷的UW液處理的DCD肝臟能夠延長(zhǎng)移植后大鼠的生存時(shí)間和生存率。
　　結(jié)論：
　　我們的研究通過建立人為模擬的DCD