匹立尼酸（Wy-14643）對大鼠移植肝冷保存再灌注損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠肝移植模型改進 目的：探索建立穩(wěn)定大鼠原位肝移植模型的方法，為進一步研究大鼠肝臟冷保存再灌注損傷提供模型基礎。 方法：選用清潔級SD大鼠建立同種異體原位肝移植模型，手術采用“Kamada雙袖套法”，并在其基礎上做適當改進，如：采用靜脈注射泵代替手工灌注，留取供體肝上下腔靜脈膈環(huán)以上2mm靜脈進行成形，并于靜脈壁左右側分別預吊縫線等。手術分為第一階段預實驗(50次)和第二階段正式實驗(50次)進行，在第二階段又

2、按術式分為“Kamada雙袖套法”(26次)和“改良Kamada雙袖套法”(24次)，并比較二種術式建立大鼠肝移植模型的效果。 結果：預試驗期間手術存活率為34.00％(17/50)，正式實驗手術存活率達90.20％(46/50)?！案牧糑amada雙袖套法”的供、受體手術時間，袖套準備及供肝修整時間，無肝期都比“Kamada雙袖套法”有明顯縮短；術后一周的存活率顯示“Kamada雙袖套法”為65.21％(15/23)，“改良K

3、amada雙袖套法”為95.73％(22/23)，統(tǒng)計分析具有顯著性差異(P<0.05)。 結論： 1.“改良Kamada雙袖套法”具有無肝期和手術時間短，手術成功率和術后存活率高的優(yōu)點，是建立大鼠原位肝移植模型較為理想的術式； 2.本實驗通過對取肝、修肝、受體肝臟切除、肝上下腔靜脈吻合、圍手術期處理等幾方面的改進，提高了模型的穩(wěn)定性和成功率。 第二部分匹立尼酸對不同冷保存時間大鼠肝臟內(nèi)PPARα、NF-

4、кB和iNOS的影響 目的：探索匹立尼酸對冷保存大鼠肝臟內(nèi)PPARα、NF-кB和iNOS的影響，研究其對移植肝冷保存損傷的作用和作用機制。 方法：將60只SD大鼠隨機分成二大組：匹立尼酸預處理組(P2)，30只，于術前2d、1d、1h分別經(jīng)尾靜脈一次注入10％DSMO8ml/kg.d+Pirinixie acid 3mg/kg.d；對照組(C2)，30只，則注入相應劑量的10％DSMO溶劑。按“改良Kamada雙袖套法

5、”切取大鼠供肝，然后，每組又按在4℃林格氏液中冷保存時間不同分為五個亞組：冷保存0h組，6只；冷保存2h組，6只；冷保存4h組，6只；冷保存6h組，6只；冷保存8h組，6只。分別于上述不同時間點分批次采取肝中葉標本，應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡技術(Western-Blot)檢測過氧化物酶體增殖物激活劑受體(PPAR)α、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA及表達蛋白量的變化，免疫組織化學法檢測肝細胞內(nèi)核因子(N

6、F)-кB活性變化，并比較二組的病理學特征。 結果：在對照組(C2)和匹立尼酸預處理組(P2)肝組織中，隨著冷保存時間的延長PPARαmRNA和表達蛋白的量都逐漸降低，但同一時間點P2組比C2組要高，統(tǒng)計學比較具有顯著性差異(P<0.05)。在C2組和P2組肝組織中iNOS mRNA和表達蛋白的量隨著冷保存時間延長都升高，但同一時間點P2組比C2組要低，統(tǒng)計學比較也具有顯著性差異(P<0.05)。同一冷保存時間點匹立尼酸預處理組

7、肝細胞內(nèi)NF-кB的激活水平低于對照組，病理損傷也較對照組輕。 結論： 1、PPARα在冷保存的大鼠肝臟中表達下調(diào)，并隨冷保存時間的延長表達水平逐漸下降(在林格氏液中冷保存，8小時內(nèi))； 2、Wv-14643對大鼠肝臟冷保存損傷具有保護作用，其保護作用是通過改善PPARα的表達下調(diào)、抑制NF-кB的活化和iNOS的病理性高表達來實現(xiàn)的。 第三部分匹立尼酸對大鼠移植肝冷保存再灌注損傷的保護作用和作用機制

8、 目的：進一步撟索匹立尼酸對大鼠移植肝冷保存后再灌注期損傷的作用，并了解其作用機制。 方法：將90只清潔級SD大鼠隨機分成三組：對照組(C3組)，18只，于術前2d、1d、1h分別經(jīng)尾靜脈一次注入10％DSMO 8ml/kg.d，只行開關腹及肝臟游離手術；匹立尼酸處理組(P3組)，36只；模型組(M3)，36只。Ms和P3組動物再隨機分成供體、受體，P3組供體于術前2d、1d、1h分別經(jīng)尾靜脈一次注入10％DSMO 8ml/

9、kg.d+Pirinixicacid 3mg/kg.d，M3組供體則注入相應劑量的10％DSMO溶劑，后二組按前述的“改良kamada雙袖套法”建立肝移植模型。然后，三組動物又以術后再灌注時間點不同再分為三個亞組：即T1：再灌注2小時，T2：再灌注6小時；T3：再灌注24小時；各6只。分別按上述時間點檢測肝組織中PPARα、iNOS mRNA及表達蛋白的量、髓過氧化物酶活力(MPO)、超氧化物酶活力(SOD)、丙二醛含量(MDA)、肝細

10、胞中NF-кB活性和血清中谷丙氨酸轉氨酶(ALT)、門冬氨酸轉氨酶(AST)、腫瘤壞死因子(TNF)α、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-2的變化，并比較三組肝臟的病理學差異。 結果：對照組(C3)術后不同時間點肝組織中PPARα、iNOS mRNA及表達蛋白的量、MPO活力、SOD活力、MDA含量、肝細胞中NF-кB活性和血清中ALT、AST、TNFα、MIP-2的都無明顯變化，肝臟的病理學無顯著改變。模型組(M3)和匹立尼酸預處理

11、組(P3)PPARαmRNA及表達蛋白的量、SOD活力、隨著再灌注時間的延長而逐漸下降，6h達到最低點，以后逐漸恢復，同一時間點三組的統(tǒng)計學比較，具有顯著性差異(P<0.05)，P3比M3組下降的幅度低，統(tǒng)計學分析也具有顯著性差異(P<0.05)。相反，肝臟中iNOS mRNA及表達蛋白的量、MDA含量和血清中ALT、AST、MIP-2在M3和P3組則于再灌注開始時上升，6小時達到高峰，以后下降，同一時間點三組的統(tǒng)計學比較，具有顯著性差

12、異(P<0.05)，P3組比M3組升高的幅度低，統(tǒng)計學分析也具有顯著性差異(P<0.05)，但MIP-2在P3組和M3組卻無顯著性差異。M3和P3組肝細胞中的NF-кB活性、血清中TNFα隨著再灌注時間的延長于開始時上升，2小時達到高峰，以后逐漸下降，同一時間點三組的統(tǒng)計學比較，具有顯著性差異(P<0.05)，P3組比M3組低，統(tǒng)計學分析也具有顯著性差異(P<0.05)，但血清中TNFα在P3組和M3組卻無顯著性差異。肝臟病理學檢查，P

13、3組比M3組損傷輕。 結論： 1、在冷保存.再灌注損傷早期(再灌注后6h內(nèi))，大鼠移植內(nèi)PPARα表達繼續(xù)下調(diào)，于再灌注6h達到最低點，24h時有所回升； 2、Wy-14643對大鼠移植肝前期(再灌注后24h內(nèi))冷保存一再灌注損傷具有保護作用，其作用是通過改善PPARα的下調(diào)表達，抑制肝細胞內(nèi)NF-кB的激活，調(diào)控肝臟內(nèi)一氧化氮合酶(iNOS)的轉錄來抑制iNOS源性NO的生成，進而抑制iNOS源性超氧化物和過氧