N-3多不飽和脂肪酸對(duì)自身免疫性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝臟是人體最大的代謝和解毒器官，同時(shí)也是一個(gè)極為重要的免疫器官。血液流經(jīng)肝臟時(shí)，帶來大量的免疫細(xì)胞，以抵抗外來抗原的入侵。富含抗原的血液進(jìn)入肝臟，通過肝竇網(wǎng)絡(luò)，被一系列抗原提呈細(xì)胞和淋巴細(xì)胞所獲取，啟動(dòng)復(fù)雜的免疫應(yīng)答過程。揭示和探索肝臟內(nèi)免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)將有利于建立調(diào)節(jié)肝臟損傷、纖維化和再生的策略，對(duì)治療慢性肝病等具有重大意義。
　　通常將具有兩個(gè)或多于兩個(gè)雙鍵的脂肪酸稱為多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty a

2、cids，PUFAs)，多不飽和脂肪酸是人體必需脂肪酸，自身不能夠合成，必需從外源食物中獲得，根據(jù)其不飽和鍵的位置可分為n-6系和n-3系PUFAs。n-3系PUFAs多存在于植物和深海魚類的體內(nèi)，是指第一個(gè)不飽和鍵在從末端甲基開始數(shù)第三個(gè)C原子與第四個(gè)C原子之間的多不飽和脂肪酸，如亞麻酸、二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)等都屬于這一類

3、。膳食脂肪酸構(gòu)成比，尤其是n-6與n-3 PUFAs比值對(duì)血脂代謝及免疫功能有不同影響，其在體內(nèi)對(duì)脂代謝和炎癥反應(yīng)的調(diào)控規(guī)律尚不清楚。肝臟作為機(jī)體脂類代謝的主要器官，游離的脂肪酸可大量循環(huán)至肝組織，因此，n-6/n-3 PUFAs比率必然會(huì)影響肝組織內(nèi)免疫微環(huán)境，從而調(diào)控肝內(nèi)的免疫防御和監(jiān)視。
　　在本文研究中，我們選用可將n-6 PUFAs內(nèi)源性轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs的一種過度表達(dá)fat-1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠作為動(dòng)物模型，探討n

4、-3 PUFAs對(duì)肝組織損傷的調(diào)控作用，旨在為當(dāng)前肝損傷疾病和慢性肝炎的臨床輔助治療提供新的視角。
　　第一章 N-3多不飽和脂肪酸對(duì)Con A誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷具有保護(hù)作用
　　刀豆素A(Con A)誘導(dǎo)的免疫性肝損傷模型能較好地模擬人類肝臟自身免疫性疾病和病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制。通過給小鼠靜脈注射Con A活化肝內(nèi)T細(xì)胞可以建立肝臟損傷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，此模型呈現(xiàn)出急性肝炎的臨床和病理組織學(xué)表現(xiàn)，包括肝臟中白細(xì)胞和淋巴細(xì)

5、胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞壞死、血清轉(zhuǎn)氨酶升高及炎性細(xì)胞因子分泌等?，F(xiàn)今此模型已被廣泛應(yīng)用于研究T細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎致病機(jī)制，從而形成了我們目前關(guān)于肝損傷過程的認(rèn)識(shí)。
　　富含n-3 PUFAs的魚油已經(jīng)作為處方藥被廣泛使用，其具有抗炎、調(diào)節(jié)血脂等健康益處，但是我們對(duì)魚油的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，其中，n-3 PUFAs對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性肝炎的調(diào)控作用也尚不清楚。
　　目的:雖然目前已有大量關(guān)于肝臟損傷過程的研究，但是其中確切的細(xì)胞和分子機(jī)制

6、還尚不清楚。越來越多的數(shù)據(jù)表明T細(xì)胞的活化在慢性肝臟損傷過程中具有相當(dāng)重要的作用。在本章研究中，我們選用可將n-6 PUFAs內(nèi)源性轉(zhuǎn)化為n-3PUFAs的一種過度表達(dá)at-1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠作為動(dòng)物模型并給予Con A誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，探討n-3 PUFAs對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性肝炎的調(diào)控作用，旨在為當(dāng)前臨床肝炎的防治提供新的視角。
　　方法:利fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠建立Con A誘導(dǎo)肝組織損傷模型，研究?jī)?nèi)源性n-3PUFAs

7、對(duì)免疫性肝損傷的作用。
　　(1)內(nèi)源性n-3PUFAs對(duì)Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷的影響
　　WT小鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)尾靜脈按35 mg/kg體重注射Con A后觀察小鼠的生存情況或按15 mg/kg體重注射ConA以誘導(dǎo)肝臟損傷。在不同的時(shí)間點(diǎn)收集血清并檢測(cè)血清中GPT的活性，分離小鼠肝組織，利用HE染色方法觀察肝組織病變，并利用TUNEL染色分析肝組織的壞死情況。
　　(2)內(nèi)源性n-3 PUFAs對(duì)Con

8、 A誘導(dǎo)小鼠肝內(nèi)T細(xì)胞活化的免疫調(diào)控作用
　　WT小鼠和at-1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)尾靜脈注射Con A后，分離小鼠肝內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞的比例，檢測(cè)CD69的表達(dá)狀況，分析細(xì)胞的活化水平;Q-PCR分析肝組織中細(xì)胞因子（如:IFN-γ、TNF-α和IL-6等）的表達(dá)，分析T細(xì)胞亞群(T-bet、GATA3、RORγt、Foxp3)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá);ELIS

9、A方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平;利用流式胞內(nèi)細(xì)胞因子染色方法檢測(cè)肝內(nèi)分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù);免疫印跡方法檢測(cè)肝組織中STAT1和STAT3的磷酸化水平。
　　(3)體外實(shí)驗(yàn)分析n-3 PUFAs對(duì)T細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用
　　分離WT小鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠的肝單個(gè)核細(xì)胞，用不同劑量Con A(1、2.5、5μg/ml)刺激72h，利用3H-TDR檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況，收集24h和48h細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測(cè)細(xì)胞

10、因子IFN-γ的表達(dá)水平;檢測(cè)不同時(shí)間刺激后肝單個(gè)核細(xì)胞STAT1和STAT3的磷酸化水平。
　　結(jié)果:(1) WT小鼠較fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠更易誘導(dǎo)自身免疫性肝損傷，內(nèi)源性n-3 PUFAs對(duì)Con A介導(dǎo)的肝組織損傷具有保護(hù)作用。靜脈注射給予fat-1小鼠組及WT小鼠組致死劑量的Con A（35 mg/kg/只）后，WT小鼠存活率顯著低于fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠;另外，WT小鼠的肝損傷程度更重，凋亡或壞死細(xì)胞更多。
　　(2

11、)內(nèi)源性n-3 PUFAs對(duì)Con A誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的分泌具有抑制作用
　　Con A刺激后，WT小鼠較fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)更高水平的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及IFN-γ，而IL-10在WT小鼠血清中的分泌則低于fat-1小鼠;此外，Th2型細(xì)胞因子IL-4和雖然在部分時(shí)間點(diǎn)分泌增多，但在兩組小鼠中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肝臟mRNA水平檢測(cè)結(jié)果與血清結(jié)果一致。
　　結(jié)論:體內(nèi)外的n-3 PUFAs對(duì)T細(xì)胞的增殖、活化

12、和炎性細(xì)胞因子的分泌均具有抑制作用，n-3 PUFAs亦可減緩自身免疫性疾病的病癥。即n-3 PUFAs對(duì)Con A誘導(dǎo)的肝組織的損傷具有保護(hù)作用。這為臨床自身免疫性肝炎的防治提供了新的視角。
　　第二章 N-3 PUFAs通過促進(jìn)肝臟自噬水平參與自身免疫性肝損傷的調(diào)節(jié)
　　自噬是細(xì)胞通過降解其自身的細(xì)胞質(zhì)（器）來為生物合成提供可循環(huán)利用的原料，借此維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和蛋白代謝平衡的過程。當(dāng)細(xì)胞處于不利環(huán)境時(shí)，它是一種重要的

13、自我保護(hù)機(jī)制，對(duì)維持細(xì)胞存活、避免凋亡有積極的作用。自噬在藥物或免疫細(xì)胞活化引發(fā)肝損傷的過程中均增多，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用，但自噬在肝臟疾病中的作用機(jī)制尚有待深入研究;另外n-3 PUFAs可促進(jìn)肝內(nèi)細(xì)胞的自噬水平，但其在ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷中的意義尚不明確。
　　目的:研究WT和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠肝內(nèi)細(xì)胞自噬水平對(duì)T細(xì)胞活化誘導(dǎo)肝組織損傷的調(diào)節(jié)作用，為通過調(diào)控自噬變化治療肝臟疾病提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。<

14、br>　　方法:(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):WT小鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠給予ConA注射后，分離小鼠肝組織，免疫印跡技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和P62的變化，檢測(cè)NF-κB信號(hào)的磷酸化水平;流式胞內(nèi)染色分析小鼠肝臟T淋巴細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)情況以及效應(yīng)T細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)的磷酸化水平。
　　(2)體外實(shí)驗(yàn):分離WT小鼠及fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠肝內(nèi)MNCs，ConA處理后，免疫印跡技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的變化;流式胞內(nèi)染色分析小鼠肝臟T淋巴

15、細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)情況;分離WT小鼠肝MNCs，體外加入DHA共培養(yǎng)，ConA處理后，流式胞內(nèi)染色分析細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)情況。
　　(3)WT小鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔給予自噬抑制劑CQ后靜脈注射ConA，檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶水平及觀察小鼠肝臟的病理情況;分析血清細(xì)胞因子的分泌;T細(xì)胞的活化情況、 T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)水平、肝組織中STAT1和STAT3的磷酸化水平等，具體方法參照上一章。
　　結(jié)果:(1)在ConA誘導(dǎo)的

16、肝損傷進(jìn)程中，內(nèi)源性n-3 PUFAs促進(jìn)肝內(nèi)自噬水平。
　　WT小鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠給予Con A刺激后，肝內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)上調(diào)，且fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠肝內(nèi)LC3的表達(dá)水平較WT小鼠更高，與LC3的表達(dá)水平相對(duì)應(yīng)的，fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠肝內(nèi)P62的表達(dá)水平較低;fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟CD3+T細(xì)胞LC3的表達(dá)水平明顯高于WT小鼠。體外將小鼠肝臟MNCs與Con A共培養(yǎng)后，fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟CD3+T細(xì)胞LC

17、3的表達(dá)水平明顯高于WT小鼠。
　　(2)內(nèi)源性n-3 PUFAs抑制肝內(nèi)和T細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)的磷酸化
　　WT小鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠給予Con A刺激后，fat-1小鼠肝臟中以及效應(yīng)T細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)的磷酸化水平明顯低于WT小鼠。
　　結(jié)論:在Con A誘導(dǎo)的肝損傷進(jìn)程中，內(nèi)源性n-3 PUFAs抑制肝內(nèi)NF-κB信號(hào)的磷酸化，促進(jìn)肝內(nèi)自噬水平，fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠肝內(nèi)自噬水平提高;用氯喹阻斷自噬后，內(nèi)源

18、性n-3 PUFAs對(duì)Con A誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用減弱或消失。即內(nèi)源性n-3 PUFAs可能通過促進(jìn)自噬來發(fā)揮對(duì)自身免疫性肝損傷的保護(hù)作用。
　　綜上，體內(nèi)外的n-3 PUFAs對(duì)T細(xì)胞的增殖、活化和炎性細(xì)胞因子的分泌均具有抑制作用，n-3 PUFAs亦可減緩自身免疫性疾病的病癥，其可能機(jī)制是促進(jìn)了肝臟的自噬。即n-3 PUFAs可能通過促進(jìn)自噬對(duì)Con A誘導(dǎo)的肝組織的損傷起到保護(hù)作用。這為臨床自身免疫性肝炎的防治提供了新的