日本血吸蟲成蟲可溶性物質(zhì)與水蛭熱刺激分泌物共同蛋白組分的相似性研究.pdf

1、目的：
　　 日本血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病，目前我國沿長江流域的湖南、湖北、江西、安徽和江蘇等地仍有流行。早期、準(zhǔn)確、快速的診斷此病，是防治日本血吸蟲病的重要環(huán)節(jié)之一,而免疫診斷又是血吸蟲病實驗診斷的重要組成部分,可以彌補病原學(xué)檢查的不足。但是，由于血吸蟲是多細(xì)胞生物，整個生活史有不同的發(fā)育階段，抗原組分多，相互間免疫交叉反應(yīng)復(fù)雜，難以分離純化，給血吸蟲病的免疫學(xué)診斷帶來極大的困難。因此，國內(nèi)外學(xué)者為了提高血吸蟲

2、病免疫學(xué)診斷的特異性進(jìn)行了大量的研究。
　　 有文獻(xiàn)報道，同屬環(huán)節(jié)動物門的蚯蚓(Lumbricus terrestris，Lt)與日本血吸蟲（Schistosoma japonica，Sj）之間存在具有免疫原性的共同交叉抗原表位，Lt作為一種異源性抗原能有效降低血吸蟲和其它寄生蠕蟲間的交叉反應(yīng)性。研究還發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲成蟲可溶性抗原與蚯蚓熱刺激分泌物之間也存在分子量相近且具有免疫活性的共同蛋白組分，并且推測導(dǎo)致這些交叉反應(yīng)現(xiàn)象的

3、物質(zhì)基礎(chǔ)可能是屬于蛋白激酶類，如蚯蚓激酶(Lumbrukinase，Lu)的一種酶類。
　　 秦志強等報道日本血吸蟲病患者血清中存在較多的抗水蛭可溶性抗原的抗體，用水蛭可溶性抗原檢測慢性血吸蟲病顯示出較好的敏感性，因而水蛭也是一種值得進(jìn)一步研究的血吸蟲異源抗原。
　　 水蛭（Whitmania pigra，Wp）俗名螞蝗，隸屬環(huán)節(jié)動物門蛭綱類(Annelida Hirudinea)，世界上有 400-500種，我國約有

4、100種，已發(fā)現(xiàn) 89種。但對于日本血吸蟲成蟲可溶性物質(zhì)與水蛭熱刺激分泌物之間的共同蛋白組分進(jìn)行分析尚未見報道。
　　 鑒此，水蛭作為一種異源抗原，和蚯蚓一樣在血吸蟲病診斷上具有潛在的研究價值。
　　 本實驗收集日本血吸蟲成蟲可溶性物質(zhì)(Schistosoma Japonicum dissolvable，Sj-Ds)與水蛭熱刺激分泌物(Whitmania pigra heat secretions，Wp-hs)，利用Do

5、t-ELISA、SDS-PAGE和Western blot技術(shù)分析兩者之間的交叉反應(yīng)性，采用噬菌體肽庫展示技術(shù)（phage display technique，PDT）篩選獲得wp-hs的抗原模擬表位，將篩選所獲得的Sj-Ds和Lu的共同模擬表位作為對照，分析其氨基酸序列相似性；同時將本課題組前期篩選所獲得的Sj抗原模擬表位、衛(wèi)氏并殖吸蟲（Paragonimus westermani，Pw）抗原模擬表位、旋毛蟲(Trichinella

6、spiralis，Ts)抗原模擬表位的氨基酸序列通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行比較分析，進(jìn)一步探討導(dǎo)致Sj間交叉反應(yīng)的重要分子基礎(chǔ)，為研究和解決臨床常見蠕蟲病血清免疫學(xué)診斷中交叉反應(yīng)現(xiàn)象提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.Sj-Ds與Wp-hs的制備及免疫交叉反應(yīng)性分析
　　 (1)Wp-hs的制備 參考熱刺激產(chǎn)生應(yīng)激蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)[5,8,9]，取水蛭 30條置于玻璃燒杯中，（40±2）℃加熱 30 min，

7、收集其分泌物。另取水蛭 10條置于室溫(20±2)℃，放置 30 min，收集其分泌物作為對照。
　　 (2)Sj-Ds的制備取新鮮Sj 200條，洗凈，按1:1的比例加入PBS (0.02 mol/L，pH 7.4)，在碾缽內(nèi)碾成糊狀后轉(zhuǎn)移至組織勻漿器內(nèi)再次研磨后取出，10000 rpm/min，30 min，取上清液置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 (3)Sj-Ds與Wp-hs的免疫交叉反應(yīng)性分析采用Dot-ELISA、

8、SDS-PAGE和Western blot，對Sj-Ds與Wp-hs進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析蛋白組分。電泳分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（nitric acid cellulose membrane，NCM），并分別與日本血吸蟲病患者血清和Wp-hs免疫兔血清進(jìn)行反應(yīng)，分析蛋白組分的交叉反應(yīng)性。
　　 2.Sj與Lu、Wp-hs共同模擬表位的篩選及交叉反應(yīng)性分析
　　 (1)Sj與Lu、Wp-hs共同模擬表位的篩選運用PD

9、T，以wp-hs免疫兔血清（Wp-hs-Ig）為靶分子，原肽庫擴增的第三輪肽庫為源肽庫進(jìn)行第一輪篩選，將第一輪篩選后所得到的洗脫液繼續(xù)以作為靶分子進(jìn)行第二輪篩選，得到Wp-hs抗原模擬表位；同時，以Lu免疫兔血清（Lu-Ig）、日本血吸蟲病患者血清（Sj-Ig）分別作為靶分子，源肽庫擴增后的第三輪肽庫為源肽庫進(jìn)行第一輪篩選，將Sj-Ig作靶分子，對用Lu-Ig篩選過的第一輪洗脫液進(jìn)行第二輪篩選，同時將Lu-Ig作靶分子，對用Sj-Ig篩

10、選過的第一輪洗脫液同法進(jìn)行第二輪篩選，得到Sj與Lu共同抗原模擬表位。
　　 (2)模擬表位交叉反應(yīng)性的分析采用SDS-PAGE和Western blot方法，對經(jīng)篩選所獲的Sj-Ds與Lu共同模擬表位進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析蛋白組分。電泳分離后轉(zhuǎn)至NCM，并與日本血吸蟲病患者血清和正常人血清反應(yīng)，分析蛋白組分的交叉反應(yīng)性。
　　 3. 分析模擬表位的氨基酸序列并與前期實驗結(jié)果的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析利用瑞士

11、日內(nèi)瓦大學(xué)分子生物學(xué)服務(wù)器SWISS－PROT (http://www.expasy.ch/sprot/)的SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，運用Blast軟件分析Sj與Lu、Wp-hs抗原模擬表位共同抗原模擬表位在血吸蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和蚯蚓蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)中進(jìn)行氨基酸序列相似性分析，同時運用該蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析本課題組前期噬菌體篩選所得到的Sj抗原模擬表位、Pw抗原模擬表位、Ts抗原模擬表位的氨基酸序列分析。
　　 結(jié)果：
　　

12、 1.Sj-Ds與Wp-hs的制備及免疫交叉反應(yīng)性分析Sj-Ds與Wp-hs之間存在著分子量 (12.6～85.4 kDa)相近的蛋白條帶。Wp-hs抗原在21.6～95.4 kDa分子量范圍內(nèi)與日本血吸蟲病患者混合血清反應(yīng)尤為明顯，且不與正常人血清反應(yīng)；Sj-Ds（40.1～89.0 kDa）與兔抗Wp-hs免疫血清能較好的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)Sj-Ds與Wp-hs之間至少存在3種具有免疫活性的共同蛋白組分。
　　 2.Sj與Lu、W

13、p-hs共同模擬表位的篩選
　　 (1)模擬表位的篩選經(jīng)過2輪的吸附－洗脫－擴增，獲得了3個A491nm值較高的克隆，通過DNA測序，經(jīng) Blast軟件分析其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)Lu-Sj與血吸蟲和蚯蚓的肌動蛋白四個不連續(xù)的氨基酸（LP-AI）一致；Sj-Lu與血吸蟲的卵殼蛋白2A前體和蚯蚓的細(xì)胞色素氧化酶C亞單位3有三個連續(xù)的氨基酸（SSL）一致；Wp-hs與血吸蟲HMG-CoA還原酶和蚯蚓的60S核糖體蛋白有四個連續(xù)的氨基酸（T

14、RLR）一致。
　　 (2)3個共同模擬表位交叉反應(yīng)性的分析將這3個模擬表位同日本血吸蟲病患者血清反應(yīng)，得到分子量為65.4 kDa的交叉反應(yīng)條帶。
　　 3. 分析模擬表位的氨基酸序列并與前期實驗結(jié)果的氨基酸序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中序列比對結(jié)果Ts4與血吸蟲6-磷酸果糖激酶與蚯蚓的NADH脫氫酶亞單位5中四個不連續(xù)氨基酸（LS-PL）一致；Pw6與E3泛素蛋白連接酶和蚯蚓的NADH脫氫酶亞單位5有四個不連續(xù)氨基酸（HY-K

15、S）是一致的；sj1與血吸蟲熱休克蛋白和蚯蚓的NADH脫氫酶亞單位5有四個連續(xù)氨基酸（LPGA）是一致的；
　　 結(jié)論：
　　 本實驗得出如下結(jié)論：
　　 1. 采用SDS-PAGE、Dot-ELISA和Western blot,發(fā)現(xiàn)Sj-Ds與Wp-hs之間至少存在3種具有免疫活性的共同蛋白組分，說明了同屬環(huán)節(jié)動物門水蛭的熱刺激分泌物均與日本血吸蟲成蟲間存在免疫交叉反應(yīng)現(xiàn)象。
　　 2.利用PDT篩選到

16、Wp-hs抗原模擬表位，運用Blast軟件分析，在血吸蟲、蚯蚓蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)中均找到了相似的氨基酸序列，通過Western blot發(fā)現(xiàn)Wp-hs抗原模擬表位能與日本血吸蟲病患者血清反應(yīng)而不與正常人血清反應(yīng)，進(jìn)一步證實了Sj與wp-hs之間存在具有免疫活性的共同交叉抗原，證實水蛭熱刺激分泌的抗原是一種蛋白，而這種蛋白是否屬于應(yīng)激蛋白，有待進(jìn)一步實驗證實。
　　 3.用Sj-Ig和Lu-Ig篩選噬菌體12肽庫獲得Lu與Sj的共同模擬表

17、位，證實了Sj與Lt存在具有免疫活性的共同抗原，且這種免疫交叉反應(yīng)物質(zhì)是一種酶類。
　　 4.利用SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫，分析本課題組前期篩選所獲得Sj、Pw、Ts抗原模擬表位，在血吸蟲和蚯蚓蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中均找到了相似氨基酸序列，證實了我們以前的設(shè)想，即推測寄生蠕蟲間導(dǎo)致交叉反應(yīng)的物質(zhì)是一類進(jìn)化過程中高度保守的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)屬于應(yīng)激蛋白中蛋白激酶類的一種蛋白質(zhì)，且與蚯蚓蛋白數(shù)據(jù)庫中的NADH脫氫酶類的酶類具有高度相似性。