ROCK抑制劑在角膜緣干細(xì)胞體外擴(kuò)增和保存中的作用研究.pdf

1、第一部分ROCK抑制劑在角膜保存中的作用研究
　　 目的：
　　 通過(guò)在角膜中期保存液中添加ROCK抑制劑Y-27632,觀察其對(duì)保存角膜上皮細(xì)胞活性率、角膜緣干細(xì)胞增殖能力、角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響。
　　 方法：
　　 新鮮兔角膜15只,4℃保存在含10μM Y-27632的角膜中期保存液中,保存時(shí)間為0、1、4、7、14天,未添加Y-27632的角膜中期保存液作為對(duì)照組。通過(guò)檢測(cè)角膜緣上皮細(xì)胞的活性率

2、、干細(xì)胞克隆形成能力,分析Y-27632對(duì)保存的角膜材料中角膜緣干細(xì)胞的影響;同時(shí),使用臺(tái)盤(pán)藍(lán)-茜素紅染色觀察中央角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的變化并計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞活性數(shù),初步評(píng)估Y-27632對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞保存的影響。
　　 結(jié)果：
　　 新鮮角膜材料在添加Y-27632的角膜保存液中保存7-14天,分離的角膜緣上皮細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的細(xì)胞活性率及克隆形成能力。對(duì)角膜內(nèi)皮行臺(tái)盤(pán)藍(lán)一茜素紅染色顯示,在添加Y-27632的角膜中期保存液保存

3、14天后,角膜內(nèi)皮細(xì)胞仍能維持其正常形態(tài),活性無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 初步試驗(yàn)結(jié)果顯示,Y-27632可作為角膜中期保存液的添加物,能夠有效延長(zhǎng)角膜上皮和角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體外的保存時(shí)間。
　　 第二部分 ROCK抑制劑在角膜緣干細(xì)胞凍存中的作用研究
　　 目的：
　　 通過(guò)在角膜緣上皮細(xì)胞的體外擴(kuò)增、凍存復(fù)蘇過(guò)程中添加ROCK抑制劑Y-27632,觀察其對(duì)角膜緣上皮細(xì)胞活性和干細(xì)胞克隆形成

4、能力的影響。
　　 方法：
　　 將新鮮分離的上皮細(xì)胞或經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的兔角膜緣上皮細(xì)胞凍存,根據(jù)凍存液及培養(yǎng)過(guò)程中是否添加Y-27632將細(xì)胞進(jìn)行不同的分組,Y-27632的添加濃度為10μM。觀察各組細(xì)胞凍存、復(fù)蘇后細(xì)胞活性、克隆形成能力等情況,評(píng)價(jià)Y-27632在角膜緣干細(xì)胞低溫凍存、培養(yǎng)中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 在角膜緣上皮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加Y-27632,可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,提高角膜緣上皮細(xì)胞的

5、克隆形成能力。將體外擴(kuò)增后的角膜緣上皮細(xì)胞進(jìn)行凍存復(fù)蘇后發(fā)現(xiàn),只在凍存液中添加Y-27632的細(xì)胞,短期凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞,在細(xì)胞活性和克隆形成能力未見(jiàn)顯著改變,但中長(zhǎng)期凍存(>14天)復(fù)蘇后的角膜緣上皮細(xì)胞,在細(xì)胞活性、增殖和克隆形成能力有明顯提高;在體外擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇全程中添加Y-27632時(shí),角膜緣上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)凍存、復(fù)蘇后其活性、增殖能力和克隆形成能力與其它組相比均有顯著提高,且其活性和功能與凍存前的水平相當(dāng)。
　　 結(jié)論：