p18小分子抑制劑體外擴增人造血干細胞的作用研究.pdf

1、目的:造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)是最早在臨床治療中進行常規(guī)應用的的干細胞類型，其具有自我更新及多向分化潛能。盡管HSCs移植已成熟地應用于治療各種類型血液系統(tǒng)惡性疾病，但由于傳統(tǒng)移植方法中，來源于骨髓或動員后外周血中的HSCs進行移植時需要供體與受體人白細胞抗原(Human leukocyteantigen，HLA)配型全相合，因而導致其在臨床應用中仍受到了較大限制。臍帶血作為一種新的HSC

2、s來源具有多種臨床應用優(yōu)勢，包括其可允許HLA部分錯配，同時移植后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率大大降低。但由于單份臍帶血中HSCs含量較低因而目前僅可滿足兒童患者及體重較低的成人患者需要。進入細胞周期是HSCs進行自我更新及擴增的最后一步，而G1期的調(diào)控可能是自我更新過程的關鍵一步。因此，為滿足臨床治療需求以及研究HSCs擴增和自我更新的調(diào)控機制，我們選擇細胞周期調(diào)控關鍵蛋白p18作為靶點，設計篩選出一系列潛在的可使HSCs體外擴

3、增小分子化合物，并進一步對其內(nèi)在機制進行研究。
　　方法:首先，我們采用慢病毒感染方式敲降人臍帶血HSCs中p18的表達，并對敲降后的細胞分別進行干細胞表型分析以及體外造血功能檢測。隨后，我們以p18作為靶點，根據(jù)前期計算機虛擬篩選的結(jié)果獲得一系列小分子化合物，并利用小鼠HSCs單細胞集落形成實驗對這些化合物的造血擴增作用進行了初步分析篩選。當確認該類小分子化合物的造血擴增作用后，我們又用這些小分子化合物處理人臍帶血HSCs，進而

4、篩選出一個效果最優(yōu)的化合物005A。通過HSCs體外培養(yǎng)濃度梯度實驗我們確定了化合物005A的最佳作用濃度。我們對化合物005A處理后的細胞進行了HSCs表型分析，隨后又對化合物005A處理后的細胞進行了體外短期、長期造血功能實驗以及體內(nèi)免疫缺陷鼠移植實驗，以進一步驗證化合物005A的造血擴增作用。我們還利用SPR實驗以及CDK6酶活性實驗檢測化合物005A對p18蛋白的抑制作用。此外我們利用單細胞PCR技術(shù)對化合物005A引起的細胞內(nèi)

5、基因變化進行了分析，據(jù)此對可能的調(diào)控機制進行研究。
　　結(jié)果:通過敲降人臍帶血HSCs內(nèi)的p18表達，我們發(fā)現(xiàn)流式細胞術(shù)檢測所得HSCs比例明顯增加，同時體外短期造血集落數(shù)量也明顯升高，體外長期培養(yǎng)中的鵝卵石樣原始造血區(qū)域頻率也顯著增加。當利用我們設計出的p18小分子抑制劑化合物對小鼠HSCs進行處理后發(fā)現(xiàn)，部分化合物可達到提高小鼠HSCs擴增的作用，其中化合物005A的ED50僅為5.2nM。隨后將該系列化合物應用于人臍帶血HS

6、Cs也發(fā)現(xiàn)了類似的作用，且化合物005A仍為效果最優(yōu)化合物。為進一步優(yōu)化化合物005A的造血擴增作用，我們采用了濃度梯度實驗，從而確定20nM為其擴增人HSCs的最適濃度，其處理后可顯著增加HSCs群體(CD34+ CD49f+)的比例。化合物005A可達到體外短期造血集落以及體外長期培養(yǎng)中的鵝卵石樣原始造血區(qū)域頻率均顯著增加的作用。造血功能檢測的金標準——免疫缺陷鼠移植實驗結(jié)果表明，化合物005A處理后細胞造血能力與未培養(yǎng)前基本相同，

7、且其移植成功率明顯升高。對化合物005A與p18蛋白的相互作用實驗發(fā)現(xiàn)，005A可與p18蛋白結(jié)合，并可抑制其活性。單細胞PCR實驗結(jié)果顯示，化合物005A處理后Notch通路相關基因表達顯著增加。
　　結(jié)論:通過對p18的表達干擾實驗發(fā)現(xiàn)，p18蛋白在人臍帶血HSCs擴增調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。因此我們認為p18是一個HSCs擴增的理想靶點。通過對p18小分子抑制劑體外造血擴增作用的研究發(fā)現(xiàn)，其可明顯提高HSCs的數(shù)量，同時又可維