二肽基肽酶-4抑制劑在慢性壓力誘導(dǎo)下對(duì)造血干細(xì)胞的影響.pdf

1、背景:二肽基肽-4(DPP4)抑制劑可以保護(hù)心血管系統(tǒng)。有研究表明，造血干細(xì)胞(HSC)的激活與慢性壓力對(duì)腦和心血管疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。根據(jù)心理情志和免疫系統(tǒng)之間的相互作用，為探究壓力和疾病的發(fā)生和發(fā)展提供了內(nèi)在聯(lián)系，以及壓力致病機(jī)理提供了研究方向，我們運(yùn)用慢性應(yīng)激模型，聚焦于論證慢性壓力激活造血干細(xì)胞(HSC)，進(jìn)而引起一系列的過激免疫應(yīng)激反應(yīng)而危害心腦血管系統(tǒng)。DPP4抑制劑，通過GLP1/GLP1R介導(dǎo)的Adrβ3/Cxcl12

2、信號(hào)通路，可以改善BM中HSC的過度活化。
　　目的:基于心理情志和免疫系統(tǒng)之間的潛在聯(lián)系，為連接慢性應(yīng)激和疾病的發(fā)生和發(fā)展奠定了基石，我們聚焦于DPP-4抑制劑，尋求DPP4抑制劑改善慢性應(yīng)激的不良反應(yīng)的理論依據(jù)——即，DPP-4抑制劑是通過對(duì)ADRβ3/CXCL12依賴介導(dǎo)的GLP-1/GLP-1R軸的抑制，而抑制骨髓造血干細(xì)胞(HSC)的活化，從而減輕外周血炎癥因子的聚集引起的炎癥反應(yīng)。
　　材料與方法:實(shí)驗(yàn)使用8周齡

3、的雄性小鼠（C57BL/6J，體重21-25g）隨機(jī)分組進(jìn)行慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)（2小時(shí)兩次/天;7天/周）正常飲食，給予慢性壓力的小鼠又隨機(jī)分成3組，不給藥組和給予DPP4抑制劑的低劑量或高的劑量（10或30毫克/kg/2次/日）。此外，對(duì)于應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中的小鼠投與艾塞那肽（10微克/kg/2次/日）。未接受慢性應(yīng)激的小鼠作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)還使用了DPP4基因敲除的大鼠(DuCrj)和對(duì)照組(F344/JCL)，并對(duì)其隨機(jī)分組，一組未接受慢性應(yīng)激作為

4、對(duì)照組，一組進(jìn)行慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)（2小時(shí)兩次/天;7天/周）正常飲食。壓力實(shí)驗(yàn)過程中記錄了體重(BW)，收縮壓(SBP)，舒張壓(DBP)，和心率(HR)，并測(cè)了血漿中的葡萄糖，尿素氮，非酯化脂肪酸(NEFA)，肌酐，高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)，血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)，甘油三酯(TG)，總膽固醇(TCH)，多巴胺(DA)，去甲腎上腺素(NA)和腎上腺素(A)。用ELISA評(píng)價(jià)血漿水平基質(zhì)衍生afactor-1(SD

5、F-1)和胰高血糖素樣蛋白-1(GLP-1)。檢測(cè)外周血的白血細(xì)胞(WBC)，紅細(xì)胞(RWC)，血小板，血紅蛋白(Hb)的，平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCV)，平均紅細(xì)胞體積(MCH)，嗜中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。小鼠和大鼠骨髓切片進(jìn)行了H&E染色和免疫染色(包括BrdU，Ki67+/Sca-1+，Ki67+/c-kit+)。使用DPPIV-GloTM蛋白酶分析試劑盒測(cè)血液以及組織（包括腦，肌肉，肝，腸，腎，內(nèi)臟脂肪，主動(dòng)脈，肺和心

6、臟）中DPP4的蛋白活性。流式細(xì)胞儀(FACS)分析以評(píng)價(jià)小鼠骨髓:c-kit+/Sca-1+，CD48-/CD150+s等造血干細(xì)胞的指標(biāo)，以及細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期（G0-G1期，S期，G2期，M期）;評(píng)價(jià)小鼠末梢血:CD45+高表達(dá)白細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，Ly6C高表達(dá)單核細(xì)胞，Ly6C陰性的巨噬細(xì)胞，CD4+/ CD8+高表達(dá)T淋巴細(xì)胞等，運(yùn)用明膠酶譜法施檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2和9的活性。免疫組織化學(xué)染色/免疫熒光染色、免疫蛋白印跡(W

7、esternBlot)多種檢測(cè)方法揭示DPP-4的抑制劑可以調(diào)控慢性壓力誘導(dǎo)激活的HSC的增殖。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，小鼠慢性壓力后皮下脂肪和腹股溝脂肪減少甚至消失，壓力組小鼠體重明顯降低，腎上腺素和去甲腎上腺素，而血漿甘油三酯也明顯降低了，而SBP以及血漿NEFA明顯增加。然而，血漿中LDL，HDL，葡萄糖，AST，BUN和肌酸的水平，在對(duì)照組和壓力組之間沒有存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。
　　1.慢性壓力可以增加血漿和各組

8、織中的DPP4活性。使用DPPIV-GloTM蛋白酶分析試劑盒，檢測(cè)對(duì)照組和慢性應(yīng)激組的血液和組織（包括腦，肌肉，肝，脾，小腸，皮下脂肪，內(nèi)臟脂肪，腎，肺和心臟）中DPP4活性。我們觀察到對(duì)照組小鼠（腦，心臟，肺，脾，小腸，皮下脂肪，內(nèi)臟脂肪，腎和肝）的組織中以及血液中的DPP4活性處于低水平。而壓力組與預(yù)期結(jié)果一致，進(jìn)行4w慢性壓力后，血液和其他組織（除了肝組織以外，腦，腎，肌肉等）DPP4的活性顯著增加;在DPP4活性變化中，變化最

9、高的表現(xiàn)為大腦——（小鼠大腦中DPP4活性與對(duì)照組相比增加了10倍;大鼠大腦中DPP4活性與對(duì)照組相比增加了20倍），這就表明受壓后極有可能由大腦首先接受壓力刺激或?qū)毫Υ碳そ邮茏顬槊舾?，而DPP4可以通過血腦屏障，自然成為了如實(shí)反應(yīng)壓力刺激的擔(dān)當(dāng)。對(duì)大腦的石蠟切片進(jìn)行H&E染色，顯示其結(jié)構(gòu)圖（增刊圖S2a中）。使用CD26抗體(CD26是DPP4其中一個(gè)別名)的免疫染色顯示，我們觀察到慢性應(yīng)激導(dǎo)致在大腦中CD26陽(yáng)性表現(xiàn)的增強(qiáng)。我們對(duì)

10、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和壓力組的DPP4活性進(jìn)行定時(shí)監(jiān)測(cè)——即，分別在壓力實(shí)施后1w，2w，3w，4w測(cè)定兩組大鼠血液中的DPP4活性，在血液中DPP4的活性隨著壓力時(shí)間的增加而增加，這表明增加的DPP4活性與壓力存在正相關(guān)的關(guān)系。此外，血漿中GLP-1和SDF-1的水平與對(duì)照小鼠相比壓力組小鼠的顯著降低。
　　2.慢性應(yīng)激活化炎癥細(xì)胞和HSC的增殖。探索壓力與白細(xì)胞增高的關(guān)系以及促使其增高后的不良影響。對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行4周應(yīng)激，運(yùn)用小動(dòng)物末梢

11、血檢測(cè)儀檢測(cè)其末梢血。與對(duì)照組相比，壓力組小鼠血液中白細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞明顯增加，這與以前的臨床自然醫(yī)學(xué)雜志的研究報(bào)道相吻合。接下來我們通過流式細(xì)胞儀(FACS)測(cè)定這些炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）在骨髓中亦顯著增多。另外，我們通過FACS也對(duì)慢性應(yīng)激對(duì)造血干細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的影響進(jìn)行了研究。細(xì)胞周期包括G0-G1期，S期，G2期，M期四個(gè)期。G1期，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間;S期(synt

12、hesis phase)，指DNA復(fù)制的時(shí)期;G2期，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時(shí)間;M期又稱D期(mitosis or division)，細(xì)胞分裂開始到結(jié)束。S/M/G2屬于細(xì)胞增殖期，應(yīng)激組小鼠骨髓細(xì)胞S/M/G2期百分比明顯增高，說明應(yīng)激后細(xì)胞處于增殖期。造血干細(xì)胞的指標(biāo)Lin-c-kit+/Sca-1+，
　　CD48+/CD150+的增多，表明造血干細(xì)胞的增多。骨髓石蠟切片使用H&E常規(guī)染色和BrdU免疫

13、組織化學(xué)染色，壓力組小鼠的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加。收集4周應(yīng)激小鼠和對(duì)照組的BM細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。4天后分別進(jìn)行Sca-1+/Ki67+ PCNA+/ CD150+雙重免疫熒光染色，雙陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加。表明壓力誘導(dǎo)BM中的HSC的增殖。探索應(yīng)激誘導(dǎo)HSC增殖的細(xì)胞機(jī)制，我們收集實(shí)驗(yàn)小鼠的大腦和BM蛋白和RNA樣本，應(yīng)用Western和RT-PCR檢測(cè)GLP-1受體(GLP-1R)和Adrβ3蛋白質(zhì)的表達(dá)以及CXCL12的基因表達(dá)。壓力

14、小鼠腦中的GLP-1R蛋白的表達(dá)和CXCL12基因表達(dá)明顯降低;而骨髓細(xì)胞的Adrβ3蛋白的表達(dá)顯著增加。運(yùn)用Gelatinzymography（基質(zhì)金屬蛋白酶活性的代表性檢測(cè)分析法明膠酶譜頻），定量分析顯示，壓力組BM細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的活性明顯增加。最近各別研究表明在慢性受壓后交感神經(jīng)的活化和BM的CXCL12的抑制之間存在密切聯(lián)系。與這些研究報(bào)道相符合的是，我們檢測(cè)的血漿中GLP-1和SDF-1的水平，壓力小鼠比對(duì)

15、照小鼠相比顯著降低。因此，壓力狀態(tài)下，白細(xì)胞的增多極有可能通過GLP1/GLP1R介導(dǎo)的Adrβ3/Cxcl12信號(hào)通路，與BM中HSC活化聯(lián)接起來。
　　結(jié)論:
　　DPP4活性于應(yīng)激下血循環(huán)和大腦中增高，提倡無創(chuàng)傷性檢測(cè)血液中的DPP4活性，可以作為應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種特異性新型的生物標(biāo)記物。此外，我們探明了DPP4通過GLP-1/GLP-1R介導(dǎo)的Adrβ3/CXCL12信號(hào)通路調(diào)控的造血干細(xì)胞的增殖活性。從而，提出了