黏附分子在生殖道黏膜免疫淋巴細(xì)胞歸巢過程中的作用.pdf

1、黏膜免疫系統(tǒng)(mucosal immune system，MIS)-----指廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺體處的淋巴組織，在結(jié)構(gòu)和功能上均有別于系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)。黏膜免疫系統(tǒng)中的黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosal associatedlymphoid tissues，MALT)包括:腸相關(guān)淋巴組織(GALT)、支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT)、鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)以及泌尿生殖道黏膜相關(guān)淋巴組織等。MALT中的

2、淋巴細(xì)胞主要是在黏膜淋巴系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行再循環(huán)，這與其表達(dá)的歸巢分子有關(guān)。MIS按功能不同可分為誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位。在誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位之間，主要通過淋巴細(xì)胞歸巢發(fā)生聯(lián)系。從黏膜誘導(dǎo)部位歸巢到效應(yīng)部位這一功能上相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)統(tǒng)稱為共同黏膜免疫系統(tǒng)(common mucosal immune system)。共同黏膜免疫系統(tǒng)在黏膜免疫中有共同的效應(yīng)，但對不同部位的黏膜，其免疫機(jī)制又有各自的特殊性，這與各器官的解剖和功能不同有關(guān)。在黏膜免疫機(jī)制的研

3、究中，胃腸道黏膜免疫系統(tǒng)研究較深入。女性生殖道是一個特殊的黏膜免疫系統(tǒng)同時又有內(nèi)分泌功能，所以生殖道黏膜免疫更為復(fù)雜。近幾年生殖道黏膜免疫系統(tǒng)的作用也慢慢被大家所關(guān)注。我們實驗室前期成功構(gòu)建了分泌hCGβ及攜分子佐劑C3d3的hCGβ-C3d3融合蛋白重組乳酸桿，并已研究證明，通過黏膜接種BALB/c小鼠，能產(chǎn)生抗hCGβ體液免疫應(yīng)答，但是對于這些參與免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞是如何歸巢及居留在生殖道的研究還很少。因此本實驗著重于研究生殖道黏膜

4、免疫后淋巴細(xì)胞歸巢相關(guān)粘附分子的表達(dá)及生殖道局部微環(huán)境對淋巴細(xì)胞歸巢的影響向，解析生殖道黏膜免疫的部分機(jī)制。
　　第一部分陰道黏膜免疫后淋巴細(xì)胞歸巢相關(guān)黏附分子的表達(dá)
　　目的:探討經(jīng)野生型及重組乳酸桿菌疫苗經(jīng)陰道黏膜接種BALB/c小鼠后淋巴細(xì)胞歸巢相關(guān)黏附分子的表達(dá)
　　方法:用磷酸鹽緩沖液(PBS)，野生型乳酸桿菌(Lb.)及重組乳酸桿菌（Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3）以1010劑量(50ul)經(jīng)陰道

5、滴注接種6～8周齡雌性BALB/c小鼠，每組10只。3周后用相同劑量加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫2周末處死小鼠，取各組子宮及陰道。部分標(biāo)本放入液氮儲存，待組織RNA提取，行實時定量PCR檢測黏附分子基因表達(dá)水平和組織蛋白提取，行Western Blot實驗，進(jìn)行蛋白定量。部分標(biāo)本用4％多聚甲醛固定24h，石蠟包埋，切片（厚度5μm），行免疫組織化學(xué)染色對黏附分子的表達(dá)進(jìn)行定位。另外應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各免疫組生殖道局部淋巴細(xì)胞表面黏附分子配體的

6、表達(dá)。
　　結(jié)果:加強(qiáng)免疫后，生殖道黏膜黏附分子的表達(dá)發(fā)生改變，黏附分子E-selectin，ICAM, VCAM, VAP-1 and E-cadherin均可以在基因和蛋白水平檢測到表達(dá)。并且絕大部分黏附分子在重組乳酸桿菌免疫后的子宮表達(dá)量增加。
　　結(jié)論:黏附分子E-selectin，ICAM，VCAM，VAP-1 and E-cadherin參與了生殖道局部淋巴細(xì)胞的歸巢。
　　第二部分生殖道粘膜免疫中歸巢淋巴

7、細(xì)胞表面高表達(dá)黏附分子相應(yīng)配體的表達(dá)
　　目的:探討經(jīng)野生型及重組乳酸桿菌疫苗經(jīng)陰道黏膜接種BALB/c小鼠后淋巴細(xì)胞歸巢相關(guān)黏附分子配體的表達(dá)
　　方法:用磷酸鹽緩沖液(PBS)，野生型乳酸桿菌（Lb.）及重組乳酸桿菌（Lb.辦CGβ和Lb.hCGβ-C3d3）以1010劑量(50ul)經(jīng)陰道滴注接種6～8周齡雌性BALB/c小鼠，每組10只。3周后用相同劑量加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫2周末處死小鼠，取各組子宮及陰道。原代分離

8、出脾臟及生殖道局部淋巴細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各免疫組生殖道局部淋巴細(xì)胞表面黏附分子配體的表達(dá)。應(yīng)用ELISA檢測各實驗組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1量的表達(dá)。
　　結(jié)果:分子佐劑C3d3能夠顯著的增加生殖道淋巴細(xì)胞歸巢相關(guān)黏附分子配體αEβ7，α4β7，LFA-1，VLA-4，PSGL-1的表達(dá)。
　　結(jié)論:加強(qiáng)免疫之后，分子佐劑C3d3可以增加黏附分子配體αEβ7，α4β7，LFA-1，VLA-4，PSGL-1的

9、表達(dá)，促進(jìn)生殖道局部T，B淋巴細(xì)胞的歸巢。加強(qiáng)免疫之后，重組乳酸桿菌免疫組可以顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)。
　　第三部分陰道黏膜免疫后局部微環(huán)境對淋巴細(xì)胞歸巢的影響
　　目的:探討各免疫組加強(qiáng)免疫后，生殖道局部微環(huán)境對淋巴細(xì)胞歸巢的影響。
　　方法:用磷酸鹽緩沖液(PBS)，野生型乳酸桿菌（Lb.）及重組乳酸桿菌（Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3）以1010劑量(50ul)經(jīng)陰道滴注接種6～8周

10、齡雌性BALB/c小鼠，每組10只。3周后用相同劑量加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫2周末處死小鼠，無菌條件下取出各組子宮及陰道。原代分離子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清，將各組培養(yǎng)上清種transwell小室的下室(600ul)，上室種各免疫組脾臟淋巴細(xì)胞(1×106/100ul)，37℃培養(yǎng)4h，收集遷移到下室的淋巴細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測遷移至下室淋巴細(xì)胞的數(shù)量和淋巴細(xì)胞的比例。另外應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各免疫組脾臟及生殖道T淋巴細(xì)胞表型的改變。