系統(tǒng)歸巢的骨髓基質干細胞在類牙髓樣組織再生過程中的作用研究.pdf

1、背景和目的
　　牙髓病、根尖周病會伴隨著牙髓的感染或壞死。作為臨床髓病治療的首選方法，根管治療可以通過有效的控制炎癥從而緩解病人的痛苦。但是其缺點在于經(jīng)過根管治療的牙齒就會徹底失去牙髓，失去神經(jīng)血管的營養(yǎng)作用，隨著時間的推移會變色，變脆，易折，抗力強度明顯降低。因此如何讓牙髓再生成為髓病研究的重中之重。
　　在牙髓再生的眾多研究方法中，外源性干細胞移植獲取牙髓再生是其中一個重要的研究方向。目前，已有若干的實驗研究證實，通過移

2、植外源性干細胞可以獲取類牙髓樣組織的再生。雖然干細胞移植所取得的研究結果讓人振奮，但是其往臨床應用的轉化卻面臨著巨大的困難及挑戰(zhàn)。一方面，干細胞的提取與培養(yǎng)，干細胞的體外擴增及儲存等程序相當復雜，另一方面，干細胞的植入方式、手段和劑量標準、免疫反應以及干細胞移植所引起的倫理等一系列的問題都是不可避免的，最后，還有一個不可忽視的問題便是干細胞移植所產(chǎn)生的高額費用。從口腔醫(yī)師的視角分析，在牙髓病的治療策略上，尋找較為實用和經(jīng)濟的方法應該是我

3、們未來研究的方向。
　　在總結國內(nèi)外最新研究成果的基礎上，通過讓內(nèi)源性細胞歸巢來替代外源性細胞移植，從而避免體外細胞培養(yǎng)和體內(nèi)細胞移植等復雜的程序而獲取牙髓再生成為新的研究焦點。骨髓基質干細胞(bone marrow stem cells，BMSCs)作為一種可以向多種組織細胞分化的多能的干細胞，已被證實可以感受外界信號刺激，趨化至機體的受損部位，同時進一步發(fā)生細胞分化而發(fā)揮其治療作用?；|細胞衍生因子-1（Stromal cel

4、l-derived factor-1，SDF-1）是一類對干細胞尤其是骨髓基質干細胞的遷移有明顯的趨化作用的趨化蛋白，可以與干細胞表面的特異性受體結合形成偶連分子對，通過偶連分子對調控細胞的粘附、運動、分泌、增殖等生物學行為。眾多實驗證實在心肌梗死、腦損傷、骨折及肺損傷等情況下，損傷區(qū)域的SDF-1表達會上調，而表達上調的SDF-1則可以募集MSCs遷移至損傷區(qū)域并修復損傷。
　　我們設想機體內(nèi)系統(tǒng)性來源的骨髓基質干細胞能否感受到

5、信號刺激，遷移并歸巢到根管內(nèi)，進一步進行細胞分化從而參與牙髓的再生。為了對我們的設想進行驗證，我們首先通過綠色熒光蛋白標記技術(GFP)對獲取的狀態(tài)良好的骨髓基質干細胞進行標記。GFP無需反應底物便能產(chǎn)生熒光，優(yōu)點是性質穩(wěn)定、敏感度高、無毒性副作用。我們通過小鼠的鼠尾靜脈將GFP+骨髓基質干細胞移植到小鼠體內(nèi)，將含有SDF-1的膠原人牙根置于小鼠的皮下袋內(nèi)，通過組織學觀察是否會有類牙髓樣的新生組織在根管內(nèi)出現(xiàn);利用GFP的示蹤功能首次探

6、討系統(tǒng)性的骨髓基質干細胞是否可以歸巢至根管內(nèi)并參與牙髓樣組織的再生過程;利用免疫熒光顯微鏡、免疫組化染色等方法觀測GFP+骨髓基質干細胞在新生的類牙髓樣組織中的分布及其可能出現(xiàn)的分化，評估外源性SDF-1促進骨髓基質干細胞向根管的歸巢并促進牙髓再生的能力。
　　材料與方法
　　1.骨髓基質干細胞的培養(yǎng)和轉染
　　我們使用的是ST2小鼠骨髓基質細胞。首先對細胞進行復蘇，并穩(wěn)定傳代。傳代后首先對最適感染復數(shù)進行確定。當感染

7、復數(shù)(Multiplicity of infection MOI)大于等于60時轉染細胞的綠色熒光表達率可明顯達到最高，故將60確定為最適感染復數(shù)。然后確定G418的最適篩選濃度。將細胞培養(yǎng)在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基中10-14天，當G418濃度大于200μ g/mL后細胞全部死亡，故確定G418的最適篩選濃度和維持濃度分別為200μ g/mL和100μ g/mL。慢病毒感染BMSCs，經(jīng)G418篩選后，可獲取GFP穩(wěn)定表達的陽性B

8、MSCs細胞，而后體外大量擴增備用。
　　2.小鼠骨髓基質干細胞的尾靜脈移植及動物模型的建立
　　收集離體正畸拔除的單根管第一前磨牙，于冠根聯(lián)合處沿近遠中向截斷牙根，行根管預備，根尖孔擴大至直徑0.5毫米。將牙根用次氯酸鈉、EDTA、無菌PBS進行系列預處理后，置于含有雙抗的PBS中備用。收集體外擴增的GFP+骨髓基質干細胞，移植組每只小鼠將100μ L細胞懸液（1×106細胞）經(jīng)尾靜脈注射移植入小鼠體內(nèi)，對照組注射100μ

9、 L不含血清的α-MEM培養(yǎng)液。在背部皮膚作一個長約1cm縱向切口，然后用止血鉗鈍性分離，暴露皮下組織，形成皮下袋，54只雄性5-7周齡小鼠，隨機分為三組:SDF-1組（置入皮下袋的牙根根管內(nèi)含有融入100ng/mL的SDF-1的中性三維膠原+尾靜脈移植GFP+骨髓基質干細胞），SDF-1空白組（置入皮下袋的牙根根管內(nèi)僅含有中性三維膠原+尾靜脈移植GFP+骨髓基質干細胞），對照組（置入皮下袋的牙根根管內(nèi)僅含有中性三維膠原+尾靜脈注射α-

10、MEM培養(yǎng)液）。牙根置入小鼠皮下袋內(nèi)并嚴密縫合，三周后處死小鼠獲取牙根標本。進行蘇木精和伊紅(HE)染色后于光學顯微鏡下觀察根管內(nèi)類牙髓樣的新生組織，同時對新生組織內(nèi)新生血管的面積進行測量并比較，以評價SDF-1對血管再生的作用。切片脫蠟水化后，用DAPI染色細胞核并通過熒光顯微鏡直接觀測GFP+細胞在根管內(nèi)新生類牙髓樣組織中的分布情況，利用圖像處理軟件檢測移植GFP+細胞的歸巢率，評價SDF-1對移植細胞歸巢的作用;用免疫組化染色的方

11、法檢測GFP+細胞在類牙髓樣新生組織中的分布及可能的分化，并檢測類牙髓樣的新生組織中堿性磷酸酶（硬組織礦化指標）的表達。
　　結果
　　1.骨髓基質干細胞的培養(yǎng)及轉染
　　ST2細胞經(jīng)過復蘇并穩(wěn)定傳代后，選取狀態(tài)良好的BMSCs細胞，利用攜帶GFP基因的慢病毒感染細胞，可通過熒光顯微鏡直接觀察轉染效果。48小時左右即可觀察到綠色熒光的出現(xiàn)，72-96小時綠色熒光達到最強，大部分細胞呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。轉染后的BMSCs

12、細胞生長狀態(tài)依然良好，形態(tài)并未發(fā)生明顯改變;經(jīng)過G418篩選后，BMSCs細胞生長狀態(tài)未受影響。篩選后將獲得的GFP+骨髓基質干細胞進行大量擴增，隨著細胞傳代，GFP+細胞生長狀態(tài)良好，GFP表達穩(wěn)定。
　　2.動物模型中GFP+骨髓基質干細胞的歸巢及根管內(nèi)類牙髓樣新生組織的形成
　　對照組中僅存有膠原組織，未觀測到成形細胞和血管的存在。在SDF-1組及SDF-1空白組中，均出現(xiàn)了類牙髓樣組織的再生、新生血管的形成、綠色熒光

13、蛋白及堿性磷酸酶的陽性表達。SDF-1空白組中，光學顯微鏡下我們可以看到殘余的膠原纖維成網(wǎng)格狀排列，網(wǎng)格中有少量細胞存在，同時視野中有少量的新生血管。倒置熒光顯微鏡下可觀測到少量的GFP+細胞（綠漿藍核），免疫組化染色顯示綠色熒光蛋白和堿性磷酸酶的表達比較微弱。在SDF-1組中，網(wǎng)格狀的膠原支架基本消失，代替它的是大量的細胞和新生血管，歸巢的GFP+細胞數(shù)總量、新生血管的面積明顯大于SDF-1空白組，綠色熒光蛋白及堿性磷酸酶的表達明顯強

14、于SDF-1空白組，SDF-1組與SDF-1空白組之間的GFP(IOD)及ALP(IOD)差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論
　　1.攜帶GFP的慢病毒能夠高效轉染骨髓基質干細胞，且轉染后的骨髓基質干細胞可以穩(wěn)定而持久表達GFP，能于體外大量擴增。
　　2.可通過內(nèi)源性細胞歸巢的方式獲取類牙髓樣組織的再生。
　　3.機體內(nèi)系統(tǒng)性來源的骨髓基質干細胞可以歸巢到根管內(nèi)并參與類牙髓樣組織再生及分化。
　　4.SDF-