法舒地爾在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞遷移中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的: 研究Rho激酶抑制劑法舒地爾(HA-1077)和VEGF對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)及向內(nèi)皮定向分化的BMSCs遷移的影響；研究法舒地爾、VEGF刺激下，BMSCs遷移與ROCK表達(dá)及細(xì)胞骨架絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)和紐蛋白(Vinculin)的關(guān)系，分析法舒地爾影響B(tài)MSCs遷移的機(jī)制。 方法: 1.采用密度梯度離心法，用密度1.077ml的淋巴細(xì)胞分離液，從大鼠骨髓中分離BMSCs，并于體

2、外純化、擴(kuò)增。 2.EGM-2培養(yǎng)液誘導(dǎo)BMSCs 7～10d，所得細(xì)胞接種于明膠包被的玻片，分別行Ⅷ因子免疫組織化學(xué)和豆蔻凝集素直接免疫熒光染色鑒定。 3.細(xì)胞增殖試驗(yàn)按2×103個(gè)/孔將BMSCs接種于96孔板培養(yǎng)24h，更換含刺激因子的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，采用MTT法，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm檢測(cè)OD值。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)平行孔4孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 4.細(xì)胞趨化試驗(yàn)按1×105個(gè)/孔(1001u1)將細(xì)胞加入Transw

3、ell上室，下室加含刺激因素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，細(xì)胞刮刮取外膜細(xì)胞，放入24孔板繼續(xù)培養(yǎng)6h，MTT法，酶標(biāo)儀490nm檢測(cè)OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞遷移率。每次設(shè)平行孔2孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 5.細(xì)胞劃痕試驗(yàn)按1×104個(gè)/孔將細(xì)胞接種于24孔板，90％融合后用10μl槍頭于每孔中央劃一垂直線，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置6h。6h后加刺激因素分別于0、6、16h攝像。ScionImage圖像處理系統(tǒng)處理照片，計(jì)算劃痕面積愈合百分比。以創(chuàng)口愈合面

4、積百分比代表細(xì)胞平行遷移率。每次設(shè)平行孔2孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 6.用羅丹明-鬼筆毒環(huán)肽和異硫氰酸熒光素-紐蛋白免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察高濃度各組和對(duì)照組細(xì)胞F-actin和Vinculin的改變。用Western blot檢測(cè)高濃度各組和對(duì)照組細(xì)胞ROCKⅠ和：ROCK Ⅱ的表達(dá)。 7.實(shí)驗(yàn)分為4組：VEGF組、HA-1077組、VEGF+HA-1077組和對(duì)照組，前三組又分低、中、高三個(gè)濃度組。VEGF三濃度為1