法舒地爾、TRPM8及microRNA-12a在骨髓間充質干細胞分化為神經細胞中的作用.pdf

1、研究背景:骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于中胚層的具有多向分化能力的干細胞,具有向軟骨細胞、骨細胞、肌細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、干細胞和造血細胞等多向分化及自我更新的功能,并且于一定條件下在體內及體外可橫向分化為神經細胞和膠質細胞。近來,已經有很多動物實驗研究報道,可以用移植骨髓間充質干細胞的方法來治療各種神經系統(tǒng)的變性疾病、腦卒中及中樞損傷等,并取得了一定的效果。
　　 Rho

2、/Rho激酶(ROCK)信號通路包括有三種成分:Rho蛋白、Rho激酶及Rho激酶的效應分子(ROCK),是體內一條重要的信號通路,主要參與了調控細胞骨架形成、細胞增殖、細胞遷移、基因轉錄和凋亡等生物行為及功能,主要通過小G蛋白GDP-GTP之間的轉換,來調節(jié)細胞內肌動蛋白骨架的聚合狀態(tài),從而扮演著“分子開關”的角色,并參與調節(jié)細胞骨架蛋白的合成、降解、移動和收縮等,因此對細胞的分裂、黏附、收縮、遷移和分泌等活動具有非常重要的調節(jié)作用。

3、我們觀察了ROCK抑制劑法舒地爾在體外誘導大鼠MSCs向神經細胞分化中的作用。
　　 TRP(transient receptor potential)通道是一類六次跨膜的非選擇性陽離子通道。它們在進化中高度保守,在哺乳動物體內廣泛表達,參與了許多重要的生理學功能,如對溫度、痛覺、聽覺的感知。TRPM8通道是TRP的一個亞家族,在人的中樞神經系統(tǒng)中表達豐富,其主要生理功能是感知低溫。令人驚奇的是,本研究在誘導MSCs分化為神經細

4、胞時,首次發(fā)現(xiàn)TRPM8出現(xiàn)表達。
　　 microRNA-124a是腦組織中表達最為豐富的一類microRNA,約占腦組織microRNA總量的25％-48％。Lim等人的研究表明,將microRNA-124a感染到HeLa細胞中導致一系列非神經細胞轉錄物的表達受到抑制,HeLa細胞的基因組表達模式向神經方向轉化。在小鼠腦組織,microRNA-124只限于在已經分化的和成熟的神經細胞中表達,而在神經前體細胞中表達很少。本研究

5、通過構建攜帶含有綠色熒光蛋白(green fluoreseence protein,GFP)報告基因的大鼠microRNA-124a慢病毒載體,將其感染至MSCs,并傳代,觀察其對骨髓間充質干細胞向神經細胞分化的影響。
　　 第一部分、法舒地爾誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經細胞分化
　　 目的:探討Rho/Rh0激酶(ROCK)抑制劑法舒地爾在體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)向神經細胞分化中的可行性。
　　

6、 方法:全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠MSCs:采用法舒地爾誘導MSCs:倒置顯微鏡觀察誘導后各組的細胞形態(tài)學變化;AO-EB染色法鑒定誘導后各組細胞存活率;免疫熒光法鑒定誘導后NSE、NF200、GFAP的表達,判斷其分化情況。
　　 結果:AO-EB染色法鑒定誘導后細胞存活率誘導后存活細胞胞質呈綠色,核為亮綠色,核形態(tài)規(guī)則,為圓形或橢圓形,死亡細胞胞質呈紅色,核呈亮紅色,核皺縮或碎裂。隨著誘導時間延長,死亡細胞數(shù)量增加。通過AO

7、-EB染色法鑒定法舒地爾誘導30min、60min、90min、120min及180min,細胞的存活率分別為96.7±2.2％、95.3±1.9％、93.8±1.8％、92.5±2.1％及90.1±1.3％。
　　 誘導后免疫熒光鑒定法舒地爾誘導組,隨著誘導時間延長,NSE、NF200表達顯著增加,GFAP表達較少。誘導后60、90、120及180min,通過免疫熒光鑒定,NSE陽性率(分別為66.5±1.9％、88.1±3.

8、2％、93.6±1.9％、93.5±5.4％),NF200陽性率(分別為70.1±2.9％、89.5±1.3％、98.1±1.6％、98.3±1.9％)并呈逐漸增加的趨勢。而各組GFAP表達率均小于5％。
　　 第二部分、TRPM8在體外骨髓間充質干細胞分化為神經細胞中的表達變化瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)是一類廣泛存在于細胞膜上的跨膜離子通道,可以辨別味覺、溫度覺等特殊感覺。

9、TRP通道亞型TRPM8主要存在于特定神經細胞的細胞膜上,當溫度低于27℃或者薄荷醇存在的條件下,TRPM8通道開放,使Ca2+等帶正電的粒子進入細胞,具有重要的生理意義。
　　 目的:本研究探討TRPM8在大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)分化為神經細胞中的表達變化和基本作用。
　　 方法:在建立體外法舒地爾誘導大鼠MSCs分化為神經細胞的基礎上,采用免疫細胞化學法、Western Blot法檢測TRPM8的表達變化。<

10、br>　　 結果:誘導前大鼠MSCs不表達TRPM8;誘導30min:MSCs開始表達TRPM8(45.3％±1.58％);誘導60min,表達較前增加(57,50％±2.45％);誘導后90min,TRPM8表達最高(89.56％±12.24％);誘導120min,TRPM8表達逐漸下降(59.25±9.15％),Western Blot也有類似的趨勢。
　　 第三部分、microRNA-124a慢病毒載體的構建及感染大鼠骨

11、髓間充質干細胞的研究
　　 目的：探討microRNA-124a在法舒地爾誘導大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)向神經細胞分化中的作用。
　　 方法：本研究構建攜帶含有綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)報告基因的大鼠microRNA-124a慢病毒載體,將其感染至大鼠骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),并傳代,采用法舒地爾誘導大鼠MSCs分化

12、為神經細胞。并于倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs感染后的熒光表達情況;采用免疫細胞化學染色和western印跡檢測神經元烯醇化酶(NSE)、神經微絲蛋白(NF200)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達變化,MTT方法檢測細胞存活率。
　　 結果：免疫細胞化學染色法感染組誘導1h后,NSE、NF200的表達率分別為83.2±2.0％,79.6±0.4％,顯著高于其它兩組(P＜0.05)。各組GFAP的表達率都小于5％,無顯著性差異。

13、
　　 Western Blot結果三組分別誘導分化1h后均表達NSE、NF200,未感染組和陰性對照組無明顯的統(tǒng)計學差異,而感染組表達的NSE、NF200較其它兩組明顯增高,有顯著差異。
　　 結論：
　　 1.本研究發(fā)現(xiàn)Rho/Rho激酶(ROCK)抑制劑法舒地爾可以在體外快速,高效的誘導大鼠MSCs向神經細胞分化。
　　 2.本研究首次報道TRPM8這種神經細胞特殊蛋白MSCs分化為神經細胞中出現(xiàn)表