肥大細(xì)胞對布魯菌模式識(shí)別與應(yīng)答效應(yīng)的體外研究.pdf

1、目的:
　　為研究肥大細(xì)胞對布魯菌的模式識(shí)別與免疫應(yīng)答效應(yīng),進(jìn)一步闡明布魯菌病的發(fā)病機(jī)制,為布魯菌病的治療和疫苗研發(fā)探索新途徑與新方法。
　　方法:
　　1.分別用布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌以MOI50:1感染肥大細(xì)胞,分別在感染后1h、12h和24h時(shí)收集上清,ELISA方法測上清中IL-6、TNF-α、LT、IL-1β、組胺、類胰蛋白酶、IL-12、IFN-γ的含量,以未處理的肥大細(xì)胞為對照。

2、r>　　2.RT-PCR法檢測正常肥大細(xì)胞TLR2、4、8與9 mRNA的表達(dá)。
　　3.分別用布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌以MOI50:1感染肥大細(xì)胞,在感染后1h、12h和24h時(shí)收集細(xì)胞,RT-PCR法測細(xì)胞TLR4、8與9 mRNA的表達(dá)。
　　4.用RNAi技術(shù)沉默肥大細(xì)胞TLR4,并設(shè)未沉默對照組,用RT-PCR法和流式細(xì)胞術(shù)檢測其沉默效果。
　　5.分別用布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株

3、和大腸桿菌以MOI50:1感染沉默組與未沉默組肥大細(xì)胞,分別在感染后1h、12h和24h時(shí)收集上清,ELISA方法測上清中IL-6、TNF-α、LT與組胺的含量。
　　結(jié)果:
　　1.布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞,1h、12h、24h感染組IL-6含量明顯高于正常組(P<0.05),且隨著感染時(shí)間的延長,IL-6含量呈增加趨勢。S2菌株感染組IL-6含量與WboA-S2菌株感染組IL-6含量比較無

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。
　　2.布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞,1h感染組TNF-α含量與正常組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05),12h、24h各感染組TNF-α含量均高于正常組(P<0.05)。S2菌株感染組TNF-α含量與WboA-S2菌株感染組TNF-α含量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。
　　3.布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞,1h、12h、24h感染組LT

5、含量高于正常組(P<0.05)。而且同一感染組在不同感染時(shí)間LT含量沒有明顯變化(P﹥0.05)。S2菌株感染組LT含量與WboA-S2菌株感染組LT含量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。
　　4.布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞,1h、12h、24h感染組組胺含量高于正常組(P<0.05)。S2菌株、大腸桿菌感染肥大細(xì)胞后組胺含量呈顯先增加,再減少,然后又增加的趨勢。WboA-S2菌株感染肥大細(xì)胞后1h、

6、12h、24h組胺含量沒有明顯變化。24h WboA-S2菌株感染組組胺含量明顯高于S2菌株感染組胺含量(P<0.05)。
　　5.在布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞的各時(shí)間點(diǎn)上清中均未檢測到IL-1β、類胰蛋白酶、IL-12和IFN-γ。
　　6.肥大細(xì)胞表達(dá)高水平的TLR4和TLR9 mRNA,TLR8 mRNA的表達(dá)豐度較低。值得注意的是肥大細(xì)胞P815不表達(dá)TLR2。
　　7.布魯菌S2

7、菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞后,在12h、24h時(shí),TLR4 mRNA的表達(dá)發(fā)生了變化。S2菌株感染肥大細(xì)胞后,TLR4 mRNA的表達(dá)隨感染時(shí)間的延長逐漸增加。WboA-S2菌株感染肥大細(xì)胞后12h,TLR4 mRNA的表達(dá)減少,24h時(shí)增多。大腸桿菌感染肥大細(xì)胞后12h,TLR4 mRNA的表達(dá)顯著增多,24h則減少。
　　8.布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞后,在12h、24h時(shí),T

8、LR9 mRNA的表達(dá)發(fā)生了變化。S2菌株感染肥大細(xì)胞后,TLR9 mRNA的表達(dá)12h時(shí)增加,24h時(shí)減少。WboA-S2菌株感染肥大細(xì)胞后,TLR9 mRNA的表達(dá)12h時(shí)無明顯變化,24h表達(dá)量增加。大腸桿菌感染肥大細(xì)胞后,TLR9 mRNA的表達(dá)12h時(shí)顯著減少,24h時(shí)顯著增加。
　　9.布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞后,在12h、24h時(shí)TLR8 mRNA的表達(dá)沒有明顯變化。
　　10.

9、確定并優(yōu)化了TLR4 RNAi沉默條件:24孔板每孔加1μl轉(zhuǎn)染試劑、6pmol TLR4 siRNA、1×105個(gè)肥大細(xì)胞,此條件下TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)抑制效果最好,轉(zhuǎn)染效率能達(dá)到50％。
　　11.布魯菌S2菌株、WboA-S2菌株和大腸桿菌感染肥大細(xì)胞,TLR4 mRNA沉默組IL-6含量明顯高于相應(yīng)未沉默組(P<0.05),TNF-α含量和LT含量與相應(yīng)未沉默組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。
　　12.

10、肥大細(xì)胞TLR4 mRNA沉默組的組胺含量與相應(yīng)未沉默組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S2菌株、大腸桿菌感染肥大細(xì)胞后,RNA沉默組組胺含量在1h時(shí)低于相應(yīng)未沉默組,12h時(shí)高于相應(yīng)未沉默組,24h時(shí)又低于相應(yīng)未沉默組。WboA-S2菌株感染肥大細(xì)胞后,RNA沉默組組胺含量在1h時(shí)低于相應(yīng)未沉默組,12h時(shí)和24h時(shí)均高于相應(yīng)未沉默組。
　　結(jié)論:
　　1.布魯菌S2菌株和WboA-S2菌株均可刺激肥大肥大細(xì)胞釋放IL-

11、6、TNF-α、LT和組胺,但不釋放類胰蛋白酶、IL-1β、IL-12和IFN-γ;
　　2.WboA基因的表達(dá)產(chǎn)物可能是刺激肥大細(xì)胞釋放組胺的主要模式配體;
　　3.肥大細(xì)胞表達(dá)高水平的TLR4和TLR9 mRNA,但TLR8 mRNA的表達(dá)豐度較低,不表達(dá)TLR2;
　　4.TLR4和TLR9參與肥大細(xì)胞對布魯菌的識(shí)別,TLR8在識(shí)別布魯菌中沒有明顯作用;
　　5.在布魯菌刺激肥大細(xì)胞分泌IL-6和組胺的過程