三種細(xì)胞用于建立體外肥大細(xì)胞脫顆粒模型的比較研究.pdf

1、中藥注射劑是我國(guó)特有的中藥劑型，是中藥應(yīng)對(duì)急癥重癥的重要手段，它是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法，將從中藥或天然藥物的單方或復(fù)方中提取的有效物質(zhì)制成無(wú)菌溶液、混懸液或臨用前配成溶液的滅菌粉末供注入體內(nèi)的制劑。中藥注射劑是傳統(tǒng)中醫(yī)藥在現(xiàn)代發(fā)展的經(jīng)典之作，它一改中藥傳統(tǒng)的給藥方式，不經(jīng)過(guò)胃腸道，直接進(jìn)入血液，起效迅速，尤其適于急癥重癥。這種給藥方式劑量準(zhǔn)確并且不受消化系統(tǒng)及食物影響，臨床上常用于神昏、抽搐、痙攣，或患消化系統(tǒng)障礙

2、的患者，有著確切的臨床療效。
　　 近些年來(lái)，隨著中藥注射劑應(yīng)用的不斷擴(kuò)大，臨床不良反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道數(shù)量也呈上升趨勢(shì)，其主要不良反應(yīng)包括皮膚及粘膜損害、呼吸系統(tǒng)損害、心血管系統(tǒng)損害及藥物熱等。同時(shí)一種癥狀類似于過(guò)敏反應(yīng)的不良反應(yīng)也時(shí)有發(fā)生，它與經(jīng)典的過(guò)敏反應(yīng)不同之處在于，經(jīng)典途徑的過(guò)敏反應(yīng)過(guò)敏原首次進(jìn)入機(jī)體后，致敏機(jī)體產(chǎn)生特異性的IgE，當(dāng)過(guò)敏原再次刺激機(jī)體時(shí)，被特異性地識(shí)別，并與抗體發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒

3、，釋放大量生物活性物質(zhì)，繼而引發(fā)一系列免疫效應(yīng);而類過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，不需預(yù)先接觸抗原物質(zhì)，也無(wú)特異性IgE參與，因其臨床癥狀與過(guò)敏反應(yīng)相似而得名，但準(zhǔn)確機(jī)制尚不明確。
　　 然而，針對(duì)注射劑的過(guò)敏反應(yīng)，《中國(guó)藥典》(2010版)僅收錄豚鼠主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)(ASA)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)(PCA)兩項(xiàng)。豚鼠易于致敏，曾是理想的過(guò)敏試驗(yàn)對(duì)象，常規(guī)的過(guò)敏試驗(yàn)也多采用豚鼠作為模型。但由于豚鼠個(gè)體較小時(shí)行為改變不夠典型和明確，加之行為學(xué)觀察本

4、身也存在較多主觀因素，使得豚鼠試驗(yàn)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。另外豚鼠的全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)主要針對(duì)依賴IgE介導(dǎo)的經(jīng)典途徑過(guò)敏反應(yīng)，檢測(cè)效果確切，但中藥注射劑常引發(fā)類過(guò)敏反應(yīng)，豚鼠試驗(yàn)的檢測(cè)效果并不理想，常出現(xiàn)漏篩的現(xiàn)象，這也是導(dǎo)致中藥注射劑過(guò)敏反應(yīng)頻發(fā)的原因之一。
　　 因此，尋找針對(duì)中藥注射劑所引發(fā)類過(guò)敏反應(yīng)的篩查模型是控制中藥注射劑用藥安全的重要舉措。本文將從體外細(xì)胞模型著手，篩選出最適宜的針對(duì)性強(qiáng)的類過(guò)

5、敏反應(yīng)體外篩查模型，作為中藥注射劑應(yīng)用于臨床前的安全性檢查，或作為篩查中藥注射劑中致敏成分的篩查模型，給中藥注射劑的安全使用和二次開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1、在常用的肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞系中篩選出一種最適合作為中藥注射劑引發(fā)類過(guò)敏反應(yīng)體外篩查模型的細(xì)胞系。
　　 2、利用臨床常用的幾種中藥注射劑，評(píng)價(jià)所篩選出的細(xì)胞系與臨床的符合率。
　　 方法:
　　 1.測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:

6、　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的三種細(xì)胞，按不同濃度接種于96孔板中，分別用MTT法與CCK-8法測(cè)定培養(yǎng)0d，1d，2d，3d，4d，5d的細(xì)胞活力，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每種細(xì)胞，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔。其中MTT組每孔加入10μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，孵育4h后吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO溶液震蕩溶解，酶標(biāo)儀570nm處測(cè)定各孔的吸光度;CCK-8組每孔加入10μL CCK-8溶液，培養(yǎng)1h后，酶標(biāo)儀450nm測(cè)定各孔的。測(cè)得吸光度利用SPSS13.0

7、計(jì)算均數(shù)及方差，分別對(duì)不同濃度的不同種類細(xì)胞利用Office Excel2010對(duì)所求得的吸光度均數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 2.篩選用于建立體外肥大細(xì)胞脫顆粒模型的細(xì)胞系
　　 2.1.組胺釋放量測(cè)定
　　 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三種細(xì)胞，接種于24孔板中，生長(zhǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基，加入Tyrode液培養(yǎng)條件下平衡10分鐘。實(shí)驗(yàn)組加入50μL C48/80，并設(shè)置空白對(duì)照組加入等體積Tyrode液。分別反應(yīng)0

8、min，15min，30min，45min和60min后終止反應(yīng)。于0-4℃以2000r/min離心10min，取上清液備用。Ku812直接以平板離心機(jī)相同轉(zhuǎn)速離心取上清液備用。
　　 2.2.高效液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法測(cè)定組胺含量
　　 C18固相萃取小柱活化后上樣，以0.2％氨水3mL沖洗，再加入3mL甲醇，收集甲醇液，室溫下氮?dú)獯蹈?，加?.5mL甲醇充分溶解后，過(guò)0.22μm濾膜備用。色譜條件:流動(dòng)相為乙

9、腈:加入0.3％甲酸的0.5mmol/L醋酸銨水溶液(60(∶)40);色譜柱:Alltima Phenyl C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流速:0.8mL/min;柱溫:35℃。用Office Excel2010軟件，以不同組胺標(biāo)準(zhǔn)品峰面積積分對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后計(jì)算各樣品組胺含量。
　　 2.3.氨基糖苷酶凈釋放度測(cè)定
　　 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三種細(xì)胞，接種于96孔酶標(biāo)板中，加入5

10、0μL底物，生長(zhǎng)48h后實(shí)驗(yàn)組每孔加入50μL C48/80;氨基糖苷酶總含量對(duì)照組加入50μL0.3％TritonX-100細(xì)胞裂解液，將全部膜裂解，釋放所有的氨基糖苷酶，作為氨基糖苷酶總含量對(duì)照組;空白組加入等量Tyrode液。分別反應(yīng)0min，15min，30min，45 min，60min后加入150μL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處各孔反應(yīng)液的吸光度，結(jié)果扣除空白對(duì)照后，以實(shí)驗(yàn)組即C48/80刺激組吸光度與氨基糖苷酶總

11、含量對(duì)照組裂解全部膜后的吸光對(duì)之比，衡量實(shí)驗(yàn)組C48/80刺激后氨基糖苷酶的釋放度。
　　 2.4.脫顆粒百分率
　　 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三種細(xì)胞，接種于24孔板中。生長(zhǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基加入Tyrode液，平衡10分鐘。實(shí)驗(yàn)組加入50μL C48/80刺激，并設(shè)置空白對(duì)照組加入等量Tyrode液。分別于0min，15min，30min，45min和60min終止反應(yīng)并以中性紅染色。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中脫顆粒細(xì)胞的個(gè)

12、數(shù)，計(jì)算出脫顆粒百分率。
　　 以上結(jié)果以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件析因設(shè)計(jì)方差分析。其中組胺測(cè)定時(shí)的峰面積積分對(duì)濃度進(jìn)行的線性回歸計(jì)算，使用Office Excel2010。
　　 3.幾種常見中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒的影響
　　 3.1.檢測(cè)幾種常用中藥注射液對(duì)P815細(xì)胞的IC50濃度
　　 中藥注射劑樣品以制劑原液為母液，稀釋為一定濃度梯度，共設(shè)置連同母液在內(nèi)的6個(gè)濃度，實(shí)驗(yàn)依次設(shè)空白對(duì)照組，

13、6個(gè)濃度的注射劑組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的P815細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)12h后，空白對(duì)照組加入50μL培養(yǎng)液，注射劑組加入50μL不同濃度中藥注射劑，繼續(xù)培養(yǎng)36h，每孔加入室溫平衡過(guò)的MTT溶液，相同條件下孵育4h，吸棄培養(yǎng)液，另加入DMSO震蕩溶解，測(cè)定各孔的吸光度，以SPSS13.0計(jì)算各注射劑品種各濃度吸光度均數(shù)，依照改良寇式法計(jì)算IC50。每種注射劑平行測(cè)定三次利用SPSS13.0取平均值。
　　 3.2

14、.幾種常見中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒的影響
　　 以篩選建立體外肥大細(xì)胞脫顆粒模型的相同方法檢測(cè)各種中藥注射劑在其IC50濃度下對(duì)P815細(xì)胞刺激60min后的組胺釋放量，氨基糖苷酶凈釋放度和細(xì)胞脫顆粒率三項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置以C48/80刺激的陽(yáng)性對(duì)照組和以Tyrode刺激的陰性對(duì)照組。結(jié)果以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件One Way Anova方法分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:
　

15、　 MTT法和CCK-8所測(cè)定的同種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)基本相同，測(cè)定結(jié)果得出RBL-2H3細(xì)胞在0.8×105個(gè)/mL-1.0×105個(gè)/mL范圍內(nèi)，P815細(xì)胞在0.5×105個(gè)/mL-0.8×105個(gè)/mL范圍內(nèi)，Ku812細(xì)胞在0.8×105個(gè)/mL-1.0×105個(gè)/mL范圍內(nèi)生長(zhǎng)曲線有明顯的指數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期，沒(méi)有明顯的潛伏期，并且48h左右能夠進(jìn)入或接近平臺(tái)期。細(xì)胞在該濃度下，適宜進(jìn)行本文后續(xù)的其他實(shí)驗(yàn)。
　　 2

16、.篩選用于建立體外肥大細(xì)胞脫顆粒模型的細(xì)胞系
　　 C48/80刺激后0-60min，三細(xì)胞系過(guò)敏活性物質(zhì)釋放均有明顯增加，以析因設(shè)計(jì)方差分析的方法統(tǒng)計(jì)后，根據(jù)交互效應(yīng)輪廓圖可見，在相同刺激條件下，P815的組胺釋放量，細(xì)胞脫顆粒率和氨基糖苷酶凈釋放度三項(xiàng)指標(biāo)的突增均明顯較其他兩種細(xì)胞系發(fā)生時(shí)間早，突增效果明顯。Ku812為懸浮細(xì)胞，細(xì)胞脫顆粒狀況不宜觀察，其結(jié)果只作為Ku812在各刺激時(shí)間點(diǎn)之間的比較，與同刺激時(shí)間點(diǎn)的其他兩種

17、細(xì)胞無(wú)可比性，這也可說(shuō)明Ku812在細(xì)胞脫顆粒項(xiàng)目下，不利于實(shí)驗(yàn)觀察。
　　 關(guān)于作用時(shí)間，根據(jù)臨床報(bào)道，類過(guò)敏反應(yīng)常發(fā)生在注射給藥后60min內(nèi)發(fā)生，將P815細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，根據(jù)交互效應(yīng)輪廓圖，選擇60min為刺激時(shí)間。
　　 3.幾種常見中藥注射劑對(duì)P815細(xì)胞脫顆粒的影響
　　 在被檢測(cè)的十二種注射劑中，血栓通注射液、清開靈注射液、雙黃連粉針劑及水針劑、香丹注射液、腫節(jié)風(fēng)注射液、膽木

18、注射液、丹參注射液、苦參堿注射液在三項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)中與陰性對(duì)照組相比均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即P＜0.05，提示上述注射劑品種對(duì)P815細(xì)胞有較強(qiáng)的致敏性;相對(duì)而言，柴胡注射液、銀杏提取物注射液、生脈注射液三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)與陰性對(duì)照組差異不顯著，提示上述三種注射劑對(duì)P815細(xì)胞的致敏性相對(duì)較弱。
　　 結(jié)論:
　　 以在P815、RBL-2H3、Ku812三種肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的細(xì)胞系中，以P815細(xì)胞系最適宜作為中藥注射劑

19、引發(fā)類過(guò)敏反應(yīng)體外篩查模型。P815細(xì)胞在C48/80刺激下，表現(xiàn)出顯著的脫顆粒反應(yīng)，且反應(yīng)結(jié)果易被量化檢測(cè)，重復(fù)性較好。在幾種常見中藥注射劑刺激下，以本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法測(cè)定，引起細(xì)胞脫顆粒程度與國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的官方公示和《藥物不良反應(yīng)通報(bào)》中所述的中藥注射劑不良反應(yīng)發(fā)生情況吻合度較高。P815細(xì)胞在臨床報(bào)道致敏性較高的中藥注射劑刺激下，所測(cè)得指標(biāo)結(jié)果與陰性對(duì)照差異明顯;同時(shí)在臨床報(bào)道致敏性不明顯的中藥注射劑刺激下，所測(cè)得指標(biāo)