濱蒿內(nèi)酯對豚鼠肥大細胞脫顆粒及細胞內(nèi)鈣的影響.pdf

1、濱蒿內(nèi)酯作為傳統(tǒng)中藥的有效單體,系從菊科植物茵陳蒿或濱蒿的花蕾及未成熟的種子中分離,又名6,7-二甲氧基-2-氫-苯并吡喃-2-酮、蒿屬香豆精、東喘寧,早期主要在復方中用于保肝利膽,后經(jīng)研究人員發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的藥理作用,如保護心腦血管、抑制腫瘤、抗腎衰、細胞保護等。本教研室在植物藥濱蒿的前期研究中發(fā)現(xiàn):主要成分濱蒿內(nèi)酯具有舒張豚鼠氣管平滑肌的作用,課題組還進行了一系列在治療哮喘及其機制方面的研究,結果顯示:濱蒿內(nèi)酯具有平喘、松弛氣道平滑

2、肌、降低氣管平滑肌內(nèi)鈣、清除氣道氧自由基、抑制氣道炎癥等作用。為了進一步明確濱蒿內(nèi)酯的作用機理,本實驗在前期研究工作的基礎上,從濱蒿內(nèi)酯對肥大細胞脫顆粒的影響入手,探討其抗過敏的作用以及對鈣離子信號變化的影響,為過敏性疾病的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 豚鼠腹腔肥大細胞的分離和純化將健康豚鼠擊頭處死,浸入75％乙醇中消毒,消毒后固定于超凈臺內(nèi)消毒木板上,剔除胸腹部毛,用75％酒精棉球消毒腹部皮膚。腹腔注

3、射預冷的RPMI1640培養(yǎng)液15ml,輕輕按摩腹部2-3min,小心打開腹腔,吸取腹腔沖洗液置于干凈的離心管中,用吸管吹打混勻。4℃,1500rpm,離心5min棄上清,將細胞懸液緩慢加入等體積比的30％:80％的Percoll梯度分離液中,4℃,2500rpm,離心15min,收集交界處的細胞,置于干凈的離心管中,吸管吹打混勻。PBS工作液洗兩次4℃,1500rpm,離心10min。鏡下計數(shù),調(diào)整細胞濃度至1×105個細胞/ml。胎

4、盤藍染色,活力大于95％。甲苯胺藍染色,純度大于90％,置于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中懸浮備用。
　　 體外致敏的肥大細胞模型將肥大細胞懸液與含1gE血清按1:1的比例混合,然后置入37℃,5％CO2孵箱中孵育2h,每管約含肥大細胞1×105個,用含1％FBS的PBS輕輕洗滌2次,去除未結合的血清。用PBS重懸后,濱蒿內(nèi)酯組肥大細胞分別加入1×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-1、1×10-7mol

5、·L-1濱蒿內(nèi)酯在培養(yǎng)箱中孵育10min,10min后加入OVA(0.2 mg·ml-1)反應8min,然后置于冰浴中5min以終止反應。致敏組在培養(yǎng)箱中孵10min后立即加入OVA(0.2mg·ml-1)反應8min,然后置于冰浴中5min終止反應。空白組以生理鹽水代替藥物。將各組試管4℃,2000rpm,10min離心,鏡下觀察,取視野下細胞相對密集區(qū)域分別測定各組100個肥大細胞中脫顆粒程度,每組10次。
　　 組胺的測定

6、分別取各組細胞,加入HC1O4(終濃度0.4mol/L),離心(4℃,4000rpm,10min),取上清。取上清液1.6ml,置于已加1.5g的NaCl的10ml帶塞試管中,加4.0ml正丁醇和0.2ml NaOH(2.5mol/L),立即混勻,置振蕩器中震蕩5min。然后取出3.6ml正丁醇相加到已加1.2ml HC1(0.1mol/L)和2ml正庚烷的帶塞試管中。震蕩5min,棄去有機相,取1ml HC1相置入10ml帶塞試管中。

7、加入1mL NaOH(0.4mol·L-1),然后立即加入0.1％鄰苯二甲醛0.2mL,振蕩混勻,37℃孵育10min,加入1.0ml,0.5mol·-1的HC1終止反應。對應的細胞用PBS重懸后經(jīng)細胞破碎儀徹底破碎,其他處理方式同上清處理。熒光分光光度計比色,檢測組胺含量,激發(fā)波長330nm,發(fā)射波長440nm。根據(jù)制定的組胺標準曲線分別計算細胞上清中組胺含量和細胞中組胺含量,組胺釋放率=上清組胺/(上清組胺+胞內(nèi)組胺)×100％。<

8、br>　　 類胰蛋白酶活力的測定方法酶活力的測定采用專用底物BAPNA(α-N-苯甲酰-D L-精氨酸-P-硝基苯胺)。BAPNA以20mg/ml溶于二甲基亞砜,混勻后取40μl加入含待測液的0.1mol·L-1反應緩沖液1.5ml中,反應緩沖液為Tris-HC1(PH7.4),30℃反應20 min后,加入0.5ml30％(v/v)乙酸終止反應,在405nm測光吸收值。以反應緩沖液做參比調(diào)零。
　　 細胞內(nèi)[Ca2+]的測定

9、將1mmol/L Fluo-3/AM按1:200體積比用無鈣液稀釋為終濃度為5μmol/L,將懸浮培養(yǎng)的肥大細胞加入已預先覆蓋多聚賴氨酸的六孔板中負載。在37℃、通氣(95％O2和5％CO2)的條件下避光負載45min,而后用PBS沖洗兩次,穩(wěn)定15min,以確保Fluo-3/AM細胞內(nèi)溶解為Fluo-3,再用倒置熒光顯微鏡觀察細胞圖像,激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長528nm。圖像分辨率為640×480像素,每偵采集時間為1s。在應用M

10、etafluo分析軟件進行圖像處理時,采用套鎖的方式選取細胞,對單個細胞進行分析。鈣離子濃度的變化用△F/F0的比值來表示,F0為基礎熒光密度值,F為給予不同工具藥后細胞的熒光密度值,△F/F0=(F-F0)/F0代表給藥后鈣離子的變化程度。
　　 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均以x-±s表示,應用SPSS16.0軟件進行單因數(shù)方差分析和t檢驗,顯著性標準用P＜0.05表示。
　　 結果:
　　 1、在肥大細胞體外致敏的情

11、況下,致敏組肥大細胞脫顆粒明顯高于正常組(P＜0.05)。濱蒿內(nèi)酯組(1×10-5mol·L-1,1×10-6mol·L-1)作用于豚鼠腹腔肥大細胞,與致敏組肥大細胞相比較脫顆粒現(xiàn)象得到了有效的改善(P＜0.05),但1×10-7mol·L-1濱蒿內(nèi)酯組與致敏組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 2、在肥大細胞體外致敏的情況下,致敏組肥大細胞釋放的組胺和類胰蛋白酶明顯高于正常組(P＜0.05)。濱蒿內(nèi)酯組(1×10-5mol

12、·L-1、、1×10-6mol·-1)與致敏組比較,組胺釋放率和類胰蛋白酶活力降低(P＜0.05),但1×10-7mol·L-1濱蒿內(nèi)酯組與致敏組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 3、在正常肥大細胞中,不同濃度的濱蒿內(nèi)酯(1×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-1、1×10-7mol·L-1)對肥大細胞[Ca2+]I具有不同程度的抑制作用并呈劑量依賴性。
　　 4、在致敏肥大細胞中,不同濃度的濱蒿內(nèi)酯(

13、1×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-1、×10-7mol·L-1)對肥大細胞[Ca2+]I具有不同程度的抑制作用并呈劑量依賴性,其中1×10-5mol·L-1濱蒿內(nèi)酯組抑制作用最明顯。與正常組相比較,濱蒿內(nèi)酯對致敏組肥大細胞的[Ca2+]I抑制作用更為顯著。
　　 結論:
　　 1、濱蒿內(nèi)酯對體外致敏的肥大細胞脫顆粒具有一定的抑制作用,其作用機制可能與抑制炎癥作用有關。
　　 2、濱蒿內(nèi)酯對體外致