新型肥大細胞傳感器的構建及用于肉毒毒素的檢測研究.pdf

1、環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測、傳染病診斷、生物恐怖現(xiàn)場處置等都迫切需要快速、準確檢測病原體和生物毒素的方法。傳統(tǒng)的檢測方法主要有形態(tài)學方法，生物化學方法，免疫學方法和核酸檢測方法。然而這些方法一般費時費力，或者靈敏度不高，其應用都存在一定的局限。核酸檢測方法具有較高的靈敏度，但其需要較純凈的樣品并且不能檢測蛋白質?；诎l(fā)光檢測的細胞傳感器是近幾年來發(fā)展起來的新型檢測技術，這種傳感器利用生物或化學發(fā)光原理，具有靈敏度高，特異性好，檢測速度快等優(yōu)

2、點，是一項具有巨大潛在價值的技術。
　　本研究目的是制備一種基于水母發(fā)光蛋白(Aequorin)的肥大細胞傳感器，并對影響檢測模型的因素進行研究，最終建立基于細胞傳感器的檢測技術，并應用于生物毒素的檢測。
　　首先將aequorin在大腸桿菌（E.coli）細胞內進行表達，以驗證序列的有效性并初步研究aequorin的發(fā)光特性。Aequorin的編碼序列(AeqD)由NCBI核酸數(shù)據(jù)庫獲得，然后對該野生型序列進行優(yōu)化，優(yōu)化后

3、的序列(命名為Aeq X)進行合成并被克隆到原核表達載體pET-his上。構建好的pET-AEQ被轉入到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中進行表達。對表達的蛋白使用Ni2+親和柱進行親和純化。取純化后的樣品和腔腸素孵育后置于發(fā)光檢測儀上自動加入CaCl2溶液然后進行發(fā)光試驗和光子計數(shù)，以測定蛋白的發(fā)光活性。隨后對aequorin的發(fā)光特性進行了一系列的研究。研究發(fā)現(xiàn)aequorin在大腸桿菌內的表達以可溶性形式存在，并且具有較高的活

4、性。發(fā)光試驗中，加入CaCl2以后，光信號在0.4 s內迅速升高到最大，然后迅速衰減，形成了一個明顯的發(fā)光脈沖峰，這是我們觀察到的aequorin的典型發(fā)光特征。試驗中發(fā)現(xiàn)β-巰基乙醇對其發(fā)光活性具有顯著影響，反應中加入β-巰基乙醇可以顯著提高aequorin發(fā)光的信號強度，并能有效降低背景信號強度。另外，在0.16 ng到1.6μg范圍內的aequorin發(fā)光活性與蛋白濃度的線性關系良好，決定系數(shù)R2達0.993。
　　然后將a

5、equorin在選用的肥大細胞內表達，篩選出穩(wěn)定表達aequorin的細胞，建立肥大細胞傳感器技術。Aeq X基因被克隆到哺乳動物細胞表達載體pEGFP-Cl上，實現(xiàn)GFP和aequorin的融合表達。將構建好的pEGFP-AEQ表達載體轉染到大鼠嗜堿性粒細胞白血病（rat basophilic leukemia，RBL）肥大細胞（RBL-2H3細胞）中，隨后對轉染的細胞置于800 mM G418的培養(yǎng)基中進行篩選至匯合率低于10％時，

6、換用400 mM的G418的培養(yǎng)基中進行篩選。然后采用有限稀釋法從穩(wěn)定細胞群中篩選穩(wěn)定轉染的克隆。使用DNP-BSA和抗DNP IgE抗體建立了肥大細胞傳感器的檢測模型，隨后對可能影響檢測的因素，包括腔腸素濃度，腔腸素孵育時間和抗體孵育時間進行了研究。通過該部分工作實現(xiàn)了aequorin在哺乳動物細胞內的高效表達，GFP-Aequorin融合蛋白的發(fā)光活性比單獨的aequorin的發(fā)光提高了約4倍。孵育了抗DNP的IgE抗體的RBL-2

7、H3細胞可以特異地識別DNP-BSA并激活細胞內的信號轉導途徑進而導致細胞發(fā)光。沒有抗原存在的情況下或者沒有孵育抗體的細胞均不能發(fā)光。說明，構建的RBL-2H3細胞可用于特定抗原的檢測，特異性較好。細胞被激活后迅速發(fā)光然后迅速衰減，形成一個明顯的發(fā)光峰，發(fā)光過程在2 min內完成，檢測需時較短。完整aequorin的形成需要一定濃度的腔腸素并孵育一定的時間，腔腸素的濃度和孵育時間可能影響aequorin的產(chǎn)率，實驗發(fā)現(xiàn)，過低濃度的腔腸素

8、導致信號值較低，而過高濃度的腔腸素會造成背景值的升高，5μM的腔腸素濃度能獲得最佳的信噪比;太短的孵育時間不能保證aequorin的產(chǎn)率，孵育時間在1h到4h都能獲得比較好的發(fā)光性能和檢測效果。另外試驗發(fā)現(xiàn)，抗體孵育時間為1h時可以獲得較好的發(fā)光和檢測效果，隨著抗體孵育時間的延長，細胞的信號值和靈敏度會迅速下降。
　　另外，為了將肥大細胞傳感器用于肉毒毒素的檢測，利用B型肉毒毒素(botulinumneurotoxin type

9、B，BoNT/B)的蛋白受體制備了一種嵌合抗體。21個氨基酸組成的序列(p21)來自BoNT/B蛋白受體突觸結合蛋白Ⅱ（synaptotagminⅡ，SytⅡ）的40-60位氨基酸序列。IgE抗體重鏈的CH3CH4結構域的序列，由GenBank數(shù)據(jù)庫獲得。由一段連接肽序列((G4S)3)將二者結合起來，構成單鏈嵌合抗體的序列(p21-CH3CH4)，序列3，端添加6×his標簽，然后將該序列進行合成，隨后被構建入pPICZα A載體上。

10、構建好的pPICZα-p21-CH3CH4被轉入到巴斯德畢赤酵母野生菌株X33中進行表達。對表達的嵌合抗體p21-Fcε進行親和層析和凝膠過濾層析，從而獲得純度較高的嵌合抗體。隨后采用免疫印跡和ELISA技術對嵌合抗體及其與BoNT/B的結合能力及特異性進行了鑒定。研究表明嵌合抗體p21-Fcε在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中以可溶的形式實現(xiàn)了高效的分泌表達，經(jīng)過純化獲得了純度較高的目的蛋白。經(jīng)免疫印跡分析，嵌合抗體在還原條件下以單體的形式存

11、在，而在非還原條件下，兩個單體之間由二硫鍵連接形成二價抗體。ELISA試驗證實嵌合抗體和BoNT/B之間具有較高的親和力，但同時與A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A，BoNT/A)復合物也有一定的結合。
　　最后將構建的肥大細胞傳感器和制備的嵌合抗體結合起來進行肉毒毒素的檢測。使用化學偶聯(lián)方法在DADPA修飾的磁珠表面偶聯(lián)BoNT/B的多克隆抗體，用于樣品的濃縮和并使單體毒素形成多聚體。將肥大細胞

12、用于BoNT/B的檢測，首先將構建的發(fā)光肥大細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，加入一定濃度的嵌合IgE抗體進行孵育，然后和5μM腔腸素進行孵育，孵育結束將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加入30μl的BSS緩沖液;進行檢測時，取20μl的磁珠和1 mL的樣品進行混合(PBS，pH7.2)于37℃孵育30 min，然后離心并移除部分上清，將剩余的混合物加入到準備好的細胞培養(yǎng)孔中。將96孔細胞培養(yǎng)板置于發(fā)光檢測儀上，儀器每隔0.5 s自動記錄發(fā)光數(shù)據(jù)

13、。研究表明細胞傳感器對BoNT/B具有較強的信號反應，產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素（Clostridium perfringens epsilon toxin，ETX)和陰性對照沒有發(fā)光信號，然而，肥大細胞對BoNT/A也有一定的反應。原因可能是BoNT/A樣品中含有血凝素-33對檢測造成了干擾。濃度為0.1 nM-10 nM的BoNT/B均能引發(fā)細胞的發(fā)光。肥大細胞傳感器對BoNT/B的檢測下限是0.1 nM BoNT/B。
　　通過上述

14、的工作，在大腸桿菌內成功表達了aequorin，對aequorin的發(fā)光活性進行了初步研究。發(fā)現(xiàn)，發(fā)光試驗可用于aequorin的定量，檢測下限可達0.16 ng，是一種有效的定性和定量檢測的方法。然后成功將aequorin在哺乳動物細胞內實現(xiàn)了表達，并成功地應用到了肥大細胞傳感器中，經(jīng)過優(yōu)化，對DNP-BSA的檢測下限達到了0.1ng/mL，靈敏度比文獻報道的提高了10倍，且檢測時間僅需2 min。另外制備的嵌合抗體p21-Fcε在巴