雞源鮑氏志賀菌O-抗原基因進化分析和O-抗原的提純及毒性研究.pdf

1、雞志賀菌病例于2004年由許蘭菊、王川慶等人首次報道，志賀菌感染雛雞主要表現(xiàn)為膿血痢，能夠引起雛雞死亡。研究顯示志賀菌具有人禽互傳的可能。O-抗原作為細菌的主要表面抗原，在細菌進化成病原菌的過程中起重要作用，又由于O-抗原具有豐富的多樣性導(dǎo)致其O-抗原基因簇的保守性很低，因此在DNA水平上研究分子進化關(guān)系，尤其在大腸桿菌和志賀菌遺傳進化關(guān)系方面，O-抗原基因簇成為最好的研究材料。本研究對雞鮑氏志賀菌O-抗原基因簇進行破譯，旨在從DNA水

2、平上對雞源志賀菌的起源和進化地位進行分析。獲得提純O-抗原多糖的方法及初步研究其毒性作用，旨在為從細菌內(nèi)毒素方面研究雞鮑氏志賀菌的致病作用奠定基礎(chǔ)。具體研究如下:
　　測定雞源鮑氏志賀菌O-抗原基因簇序列，進行遺傳進化分析，并對其基因功能預(yù)測。采用長程PCR方法擴增O-抗原基因簇，設(shè)計6對相互嵌合引物，克隆測序，拼接后獲得全基因序列，用生物信息學(xué)方法完成基因注釋并預(yù)測其功能，對galF和gnd基因進行遺傳演化分析。結(jié)果顯示雞源鮑氏

3、志賀菌O-抗原基因簇序列全長為12742 bp，其與人源鮑氏3型志賀菌和大腸桿菌O167的同源性最高，其核苷酸同源性分別為99.9％和99.8％;氨基酸同源性分別為99.9％和99.5％。共發(fā)現(xiàn)9個基因:吡喃型UDP-半乳糖變位酶基因(glf，1089 bp)、O-抗原轉(zhuǎn)運酶基因(wzx，1266 bp)、O-抗原聚合酶基因(wzy，1251 bp)和糖基轉(zhuǎn)移酶基因(orf3,1203bp; orf4,855bp; orf5,969bp

4、; orf7,1092 bp; orf8,639 bp; orf9,633 bp)。研究表明人源鮑氏3型志賀菌可能由大腸桿菌O167進化而來，而雞源鮑氏志賀菌可能來源于人源鮑氏3型志賀菌。
　　為獲得高純度的雞鮑氏3型志賀菌脂多糖(LPS)及其亞單位O抗原多糖(O-PS)，采用改良熱酚水法提取雞源志賀菌的LPS，并聯(lián)合使用葡聚糖凝膠層析得到高純度的LPS;采用酸水解法聯(lián)合葡聚糖凝膠層析獲得高純度的O-PS。PAGE銀染結(jié)果顯示LP

5、S呈現(xiàn)不均一的梯形帶，對提取物進行蛋白質(zhì)和核酸含量測定顯示所提純LPS和O-PS純度高，LPS蛋白含量僅為1.83％，O-PS蛋白含量僅為0.28％。本試驗結(jié)果表明提取的LPS和O-PS可進行特異性研究及制備有效的候選疫苗。
　　為研究雞源鮑氏志賀菌脂多糖(LPS)亞單位O-抗原多糖(O-PS)的特異性致病作用。采用改良熱酚水法并聯(lián)合葡聚糖凝膠層析得到高純度的LPS;采用酸水解法聯(lián)合葡聚糖凝膠層析獲得高純度的O-PS，對其進行體內(nèi)

6、外試驗，觀察其毒性作用并與LPS作對比。結(jié)果顯示0.25～250μg/mL范圍內(nèi)的O-PS處理的Hela細胞組與對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)，表明雞源鮑氏志賀菌O-PS對Hela細胞的增殖具有損傷作用，可引起Hela細胞病變，而LPS不能引起細胞病變;O-PS體內(nèi)兔回腸襻試驗中僅引起腸粘膜輕微出血;而LPS能引起回腸壁充血、水腫及化膿，對腸粘膜造成嚴重損傷。本研究表明雞源鮑氏志賀菌LPS的亞單位O-PS具有細胞毒性作用，但其毒