抗凝蛋白EH的藥效學(xué)及蛋白表達(dá)的優(yōu)化.pdf

1、新型抗凝蛋白EPR-Hirudin(EH)，是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的新型重組抗凝蛋白。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)和大鼠頸動(dòng)脈血栓模型、大鼠下腔靜脈血栓模型、犬冠狀動(dòng)脈血栓模型，分別驗(yàn)證了EH抑制動(dòng)、靜脈血栓形成的藥效學(xué)特性，并與臨床常用的抗凝藥-低分子肝素鈉和水蛭素進(jìn)行了對(duì)比。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EH在裂解前沒有抗凝活性；經(jīng)凝血因子裂解后，表現(xiàn)出抗凝血酶活性，這說明EH符合設(shè)計(jì)初衷。在電刺激大鼠頸動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)中，EH組OT值明顯延長(zhǎng)。4mg/kg的E

2、H抗栓效果與2mg/kg的水蛭素相當(dāng)，雖然EH的用量增加了一倍，但出血傾向只有水蛭素的一半。大鼠下腔靜脈血栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠靜脈注射EH后，血栓干重和血栓纖維蛋白量劑量依賴性減少。等劑量的EH與水蛭素的抗凝作用強(qiáng)度相似，這是由于靜脈血栓的形成速度較慢，EH可以得到充分的裂解。靜脈給予EH，對(duì)大鼠斷尾出血時(shí)間無(wú)顯著性影響，TT、PT值也沒有明顯升高。因此EH的出血傾向明顯低于HV和低分子肝素。犬冠狀動(dòng)脈血栓模型顯示，劑量3.0mg/kg

3、的EH與85IU/kg的低分子肝素鈉的抗血栓效率相同；兩者對(duì)TT、PT、APTT、Fbg的影響均無(wú)明顯差異（P>0.05），且EH組出血量較低分子肝素鈉組明顯減少（P<0.05）。因此，在相同的抗血栓效率下，EH的出血副作用小于低分子肝素鈉和水蛭素。
　　本文從工藝水平和基因水平分別對(duì)EH蛋白的生產(chǎn)進(jìn)行了研究。EH的宿主細(xì)胞是畢赤酵母GS115，在表達(dá)外源蛋白EH的過程中，羧肽酶Y能夠從羧基末端降解EH蛋白。根據(jù)羧肽酶的活性特點(diǎn)，

4、本文采用甘油和金屬離子為主的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并在誘導(dǎo)表達(dá)期，將PH設(shè)置為3.0，溫度設(shè)置為27℃。同時(shí)采用陶瓷膜過濾和膜包超濾等方法，快速分離發(fā)酵液。通過上述工藝設(shè)計(jì)，EH蛋白的降解率由30％減少到15%，200L菌液的蛋白產(chǎn)量由19.1±1.7g提高到24.7±1.9g。為了完全消除羧肽酶Y對(duì)EH的降解，本文通過同源重組法，將羧肽酶基因cpy替換為潮霉素B抗性基因hygro，構(gòu)建了羧肽酶Y基因cpy缺失的菌株GS115Δcpy，并通過錐形