大流行流感裂解疫苗的研制及關鍵技術的研究.pdf

1、當前，高致病性人禽流感H5N1已在15個國家和地區(qū)發(fā)生，死亡率高，特別是印尼家族性感染被美國科學家證實為人傳染人事例后，使得大流行流感防控形勢異常嚴峻。WHO預言，下一次流感大流行不是有和無的問題，而是早和晚的問題。因此，做好大流行流感疫苗研發(fā)和關鍵技術平臺的研究，已成為世界各國應對流感大流行采取的重大舉措。 疫苗免疫接種是控制高致病性人禽流感最有效而經濟的手段之一，但面臨著高致病性人禽流感病毒H5N1毒株變異、雞胚生產疫苗原料

2、來源受限、注射接種繁復等重大問題。因此WHO要求全球加快大流行流感疫苗研發(fā)和關鍵技術儲備研究進程，為應對流感大流行做好充分的準備。 目前，高致病性人禽流感病毒H5N1感染主要分布在亞洲，特別是印尼、越南和中國，對其分離的毒株進行血清學、致病性和基因結構等分析表明，高致病性人禽流感病毒H5N1具有高度變異的特性，就中國分離的毒株存在南北之分。因此，WHO要求各國開展大流行流感原型疫苗的研究。目前大流行流感疫苗的研究重點主要集中在滅

3、活全病毒疫苗、裂解疫苗、減毒噴鼻疫苗、亞單位疫苗等。其中裂解疫苗具有不可多得的優(yōu)勢：與全病毒滅活疫苗僅可用于成年人的特點比較，可廣泛用于各類人群，尤其是作為禽流感病毒的高危人群-老人和12歲以下的兒童；不存在減毒疫苗毒力恢復的缺點，更安全；較亞單位疫苗具有更強的免疫原性和制各簡單等優(yōu)勢。目前，大流行流感裂解疫苗已成為世界著名疫苗企業(yè)和研究機構介入的重點，并取得了階段性成果，為流感大流行作好了充分的準備。 基于大流行流感裂解疫苗應

4、對流感大流行具有不可多得的優(yōu)勢，我們在國內率先成功研發(fā)了大流行流感裂解疫苗，解決了我國“無”和應急的問題。同時圍繞大流行流感疫苗關鍵技術平臺：針對高致病性人禽流感病毒H5N1不斷變異，需要運用RG技術來快速制備疫苗株的問題、雞胚生產原料來源和質量的問題、注射免疫不能產生全面免疫應答和接種復雜的問題進行了研究，其研究進展如下： 大流行流感裂解疫苗的研制：我們從美國CDC引進大流行流感疫苗株VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N

5、1)，該疫苗株是利用反向遺傳學技術，將高致病性人禽流感病毒A/VietNam/1203/2004(H5N1)的HA、NA基因定點突變后和PR8的6個內部基因進行重組，得到大流行流感疫苗減毒株。 開展了大流行流感裂解疫苗種子批庫的研究。通過SPF雞胚傳代建立了大容量符合疫苗生產的原始種子批、主種子批和工作種子批庫。分別對大流行流感疫苗各種子批進行了血凝滴度的檢測、病毒型別的檢定、EID50、無菌實驗、支原體檢測、外原因子檢測及動物

6、實驗，實驗證實建立的原始種子批、主種子批和工作種子批庫具有安全、有效和穩(wěn)定，符合WHO規(guī)定大流行流感疫苗生產的要求。 開展了大流行流感裂解疫苗原液生產的研究。通過健康雞胚培養(yǎng)、收獲、滅活、裂解大流行流感裂解疫苗病毒，制備疫苗生產裂解病毒抗原。實驗表明病毒培養(yǎng)溫度為33℃、培養(yǎng)時間為52h，病毒滅活采用1:4000的甲醛20～25℃滅活72h，病毒的純化使用凝膠過濾Sepharose4FastFlow，病毒裂解選擇濃度為0.5％的

7、TritonX-100，室溫作用2.0h，建立了疫苗生產的最佳生產工藝，制備了大流行流感裂解疫苗原液。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗成品和有效性的研究。選用鋁鹽佐劑，采用動物模型和抗原吸附率檢測進行鋁佐劑濃度的確定，確定的鋁佐劑濃度為1.2mg/ml。選用3.75、7.5、15.0、30.0、45.0、60.0、75.0、90.0μg/0.5ml8個疫苗劑量組，分別肌肉免疫小鼠和豚鼠，對疫苗免疫原性進行了初步研究。通過血凝抑制

8、實驗來篩選疫苗的有效劑量，結果表明加鋁鹽佐劑的7.5、15.0、30.0μg/0.5ml是最佳的疫苗劑量組。我們同時對小鼠和豚鼠免疫一針和兩針時的免疫效果進行了統(tǒng)計分析，表明免疫兩針效果明顯優(yōu)于一針。因此，確定的大流行流感疫苗臨床試驗為7.5、15.0、30.0μg/0.5ml成品劑量組，免疫兩針，為臨床研究提供了依據。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗安全性和穩(wěn)定性的研究。通過動物過敏實驗、異常毒性實驗、急性毒性實驗、熱源質實驗

9、，結果表明大流行流感裂解疫苗無毒性，使用安全。將大流行流感裂解疫苗成品置2～8℃、室溫(22～25℃)、37℃，通過解吸附單擴實驗驗證抗原含量，免疫Balb/c小鼠測定疫苗效力(中和抗體)，通過pH儀檢測pH值，外觀的觀察來鑒定疫苗穩(wěn)定性，并通過疫苗加速實驗，證明制備的大流行流感裂解疫苗可在2～8℃保存兩年以上。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗Ⅰ期臨床研究，通過雙盲實驗完成了疫苗安全性、有效性研究，實驗證明制備的疫苗安全、有效。

10、 大流行流感疫苗關鍵技術的研究：圍繞大流行流感疫苗研發(fā)中的疫苗毒株、培養(yǎng)介質和免疫途徑的關鍵技術問題進行了研究，為應對流感大流行疫苗快速研發(fā)做好準備。 一是針對高致病性人禽流感病毒H5N1高度變異的問題，開展了RG技術用于疫苗株的拯救。因為高致病性人禽流感病毒H5N1高度變異，需要不斷更換疫苗株，而快速、及時對流行株獲得大流行流感疫苗株將是有效控制流感爆發(fā)流行的首要環(huán)節(jié)之一。我們通過流感病毒8質粒拯救系統(tǒng)，在BSL-3培

11、養(yǎng)A/Anhui/1/2005(H5N1)病毒，提取病毒RNA，利用基因重配技術將該病毒的HA(定點突變)、NA構建到雙向表達質粒pHW2000上，將構建好的2質粒和PR86質粒共轉染COS-1細胞，獲得重組的PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒。運用RT-PCR.、血凝實驗、電鏡、間接免疫熒光實驗檢測拯救的重組疫苗株病毒。實驗結果表明，拯救PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒基因序列正確，血凝滴度達到1:320以上

12、；電鏡下病毒形態(tài)正常，成絲狀和囊狀。CPE證實病毒毒力明顯降低，符合大流行流感疫苗株的要求，在國內率先建立了反向遺傳學拯救流感疫苗株的關鍵技術平臺。 二是針對大流行流感疫苗生產原料來源的問題，開展了Vero細胞替代雞胚生產疫苗的研究。構建了pCDNA3.1-ST3GalⅢ表達載體，轉染、G418加壓篩選Vero細胞，獲得穩(wěn)定高效表達高致病性人禽流感病毒受體的Vero細胞株。運用改造好的Vero細胞株培養(yǎng)PR8/A/Anhui/1

13、/2005疫苗株病毒，通過細胞病變和血凝實驗結果證明，PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒感染Vero細胞病毒復制滴度提高，TCID50達到106.5-7，較普通的Vero細胞提高了100-150倍，初步建立了Vero細胞生產大流行流感疫苗的細胞系。我們將Eng53/v-aNS基因置換了8質粒系統(tǒng)的NS基因，重組病毒理論上可在Vero細胞上大量復制，但我們的實驗結果卻與預期值有差異，進一步實驗仍在進行中。 三是噴鼻型大

14、流行流感疫苗的研究，噴鼻大流行流感疫苗具有快速、簡便大規(guī)模接種、免疫保護譜廣的特點。將大流行流感裂解疫苗分別使用不同的佐劑，采用不同的免疫途徑，分別檢測唾液、肺灌洗液中分泌型IgA，血液中的IgG、IgA，以及運用HI實驗來確定噴鼻疫苗最佳劑型和最佳免疫途徑。結果表明，蛋白體佐劑與VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N1)制備的噴鼻型大流行流感裂解疫苗具用良好的免疫原性和安全性，其分泌型IgA是各類佐劑中最高的，其中肺灌洗液中IgA

15、滴度為1:640，HI實驗結果也證明，運用蛋白體佐劑噴鼻免疫大流行流感裂解疫苗將是一個具有良好開發(fā)前景的舉措，。 結論：為加快適應和滿足我國流感大流行疫苗研發(fā)和關鍵技術儲備能力的需求。我們在應急上，已完成針對越南株大流行流感裂解原型疫苗的研究；圍繞疫苗研發(fā)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略上，針對高致病性人禽流感病毒H5N1株變異問題，建立了快速制備疫苗株的技術平臺、針對疫苗生產原料來源和質量難以控制的特點，初步建立了Vero細胞替代雞胚生產疫苗的