EPG結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究新蚜蟲(chóng)癘霉侵染桃蚜致病機(jī)理初探.pdf

1、桃蚜是多種蔬菜和農(nóng)作物的重要害蟲(chóng),不僅吸食植物汁液,而且還是多種植物病毒病的重要媒介昆蟲(chóng)。蚜蟲(chóng)?；圆≡婢卵料x(chóng)癘霉(Pandora neoaphidis)是自然界中分布最廣泛的蟲(chóng)霉目昆蟲(chóng)病原真菌,可以侵染蚜蟲(chóng)進(jìn)而引發(fā)流行病,導(dǎo)致蚜群數(shù)量的急劇下降,是各種蚜蟲(chóng)的重要自然控制因子。本文以桃蚜(Myzus persicae)和新蚜蟲(chóng)癘霉為研究對(duì)象,利用刺探圖譜技術(shù)(EPG)觀察感病不同時(shí)期桃蚜與正常取食桃蚜的取食狀態(tài)差異,同時(shí)通過(guò)分析實(shí)時(shí)

2、熒光定量 PCR技術(shù)(qPCR)篩選得到能夠穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,并利用該內(nèi)參基因進(jìn)行了新蚜蟲(chóng)癘霉在蚜蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)的相對(duì)定量,這為進(jìn)一步研究新蚜蟲(chóng)癘霉和桃蚜的互作,探索關(guān)于新蚜蟲(chóng)癘霉侵染桃蚜的致病機(jī)理提供了理論依據(jù)。本研究得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)基于 EPG技術(shù)測(cè)定感染新蚜蟲(chóng)癘霉的桃蚜和未感病正常桃蚜(對(duì)照)在實(shí)驗(yàn)植物上的各種刺吸波形,以取食波np、c、pd、E1、E2出現(xiàn)時(shí)間和次數(shù)為主要考慮的表征參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):

3、桃蚜在感染新蚜蟲(chóng)癘霉后,其取食行為包括取食行為中覓食時(shí)間(c波)變長(zhǎng),真正取食時(shí)間(E波)變短,非刺探(np波)次數(shù)與時(shí)間等受到一系列影響。
　　桃蚜受新蚜蟲(chóng)癘霉感染死亡前16小時(shí)與正常桃蚜的各種表征參數(shù)的比較表明,np波平均時(shí)間和平均次數(shù)差異均不顯著;出現(xiàn)C波平均時(shí)間和平均次數(shù)差異極顯著;出現(xiàn)pd波平均時(shí)間和平均次數(shù)差異也極顯著,而出現(xiàn)的E1波平均時(shí)間和次數(shù)差異均不顯著;有趣的是,感病組出現(xiàn)的E2波平均時(shí)間與未感病組的平均時(shí)間差

4、異顯著;而出現(xiàn)的E2波平均次數(shù)卻差異不顯著。
　　桃蚜受新蚜蟲(chóng)癘霉感染后6小時(shí)與正常桃蚜的各種表征參數(shù)的比較表明,兩組處理出現(xiàn)的np波和C波平均時(shí)間差異不顯著,但出現(xiàn)的np波和C波平均次數(shù)的差異卻表現(xiàn)顯著;出現(xiàn)的pd波平均時(shí)間和平均次數(shù)差異顯著;但第一次出現(xiàn)pd波的時(shí)間差異不顯著。另外,出現(xiàn)的E1波、E2波的平均時(shí)間和平均次數(shù)差異不顯著。
　　(2)本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了新蚜蟲(chóng)癘霉中3個(gè)傳統(tǒng)管家基因18S、28S

5、、EF1 mRNA表達(dá)差異情況,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件綜合分析了它們?cè)?種生長(zhǎng)階段(分生孢子、萌發(fā)管時(shí)期、短菌絲和長(zhǎng)菌絲)和3種營(yíng)養(yǎng)條件(GLEN培養(yǎng)基、OS-SDB培養(yǎng)基和Grace培養(yǎng)基)下表達(dá)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明:基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列設(shè)計(jì)的候選內(nèi)參基因的引物具有良好的擴(kuò)增效率和特異性。經(jīng) geNorm軟件分析,新蚜蟲(chóng)癘霉在不同生長(zhǎng)階段和不同營(yíng)養(yǎng)條件下3個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性(M值)等級(jí)分

6、別為:18S(0.457)>28S(0.534)>EF1(0.749)和18S(0.389)>28S(0.557)>EF1(0.607)。利用NormFinder軟件分析,新蚜蟲(chóng)癘霉不同生長(zhǎng)階段和不同營(yíng)養(yǎng)條件下3個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性(穩(wěn)定值)等級(jí)分別為:18S(0.084)>28S(0.264)>EF1(0.509)和18S(0.118)>28S(0.355)>EF1(0.403)。而 BestKeeper軟件分析得到的穩(wěn)定性等級(jí)

7、有所差異,在不同生長(zhǎng)階段和不同營(yíng)養(yǎng)條件下候選內(nèi)參基因28S表達(dá)最穩(wěn)定,18S次之,EF1最不穩(wěn)定。綜合分析3款軟件對(duì)熒光定量PCR結(jié)果的穩(wěn)定性等級(jí)的平均值,得出在不同生長(zhǎng)階段和不同營(yíng)養(yǎng)條件下候選內(nèi)參基因18S表達(dá)最為穩(wěn)定。
　　(3)利用能夠穩(wěn)定表達(dá)的基因18S作為內(nèi)參,通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)新蚜蟲(chóng)癘霉在桃蚜體內(nèi)的增殖過(guò)程進(jìn)行了初步的探索。建立了Chelxe-100快速提取DNA的方法,同時(shí)利用該方法提取感病桃蚜的基因組 DNA

8、,對(duì)新蚜蟲(chóng)癘霉侵染7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蚜尸進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR。通過(guò)分析基因的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果,我們獲得了能夠較好地模擬新蚜蟲(chóng)癘霉在桃蚜體內(nèi)增殖的方程。
　　綜上所述,本研究利用EPG技術(shù)觀察感病不同時(shí)期桃蚜與正常取食桃蚜的取食狀態(tài)差異,從宏觀的角度對(duì)新蚜蟲(chóng)癘霉侵染桃蚜的致病過(guò)程進(jìn)行了描述,同時(shí)通過(guò)分析實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)(qPCR)篩選得到的內(nèi)參基因18S對(duì)新蚜蟲(chóng)癘霉在蚜蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)增殖的微觀狀態(tài)進(jìn)行了研究。通過(guò)宏觀和微觀的內(nèi)外相結(jié)