G蛋白偶聯(lián)受體48基因敲除小鼠研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptor,GPCR)是參與跨膜信號傳導(dǎo)的膜受體.近年發(fā)現(xiàn)的GPCR家族新成員G蛋白偶聯(lián)受體48(GPR48/LGR4)是功能未知的孤兒受體.根據(jù)其結(jié)構(gòu)分類于GPCR的A家族糖蛋白激素受體.目前國際上對GPR48/LGR4的研究報道屈指可數(shù),研究結(jié)果提示可能參與生殖與發(fā)育.本文通過研究GPR48/LGR4基因敲除(K0)小鼠,了解GPR48/LGR4:的分布和功能,并進一步探討G

2、PR48/LGR4參與雄性不育的發(fā)病機制,以及它與下丘腦-垂體-性腺構(gòu)成的經(jīng)典神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)軸的關(guān)系,為尋找配體提供線索. 本研究通過對GPR48/LGR4KO小鼠的表型觀察,初步探討GPR48/LGR4的功能.用RT-PCR、原位雜交、LacZ染色方法觀察GPR48/LGR4在小鼠主要器官表達分布.通過器官體重比值,大體解剖學(xué)、組織學(xué)等形態(tài)學(xué)的方法觀察GPR48/LGR4KO雄性小鼠性腺、生殖道發(fā)育和GPR48/LGR4KO小

3、鼠圍產(chǎn)期死亡的原因.電鏡觀察不同基因型的雄性小鼠生精小管和附睪管上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)差異.ELISA方法測定小鼠血漿LH、FSH、T水平,比較不同基因型的雄性小鼠間差異.首次通過酶標(biāo)免疫組化和熒光免疫組化方法比較GPR48/LGR4KO小鼠與野生型(WT)小鼠輸出小管和附睪管上皮細胞發(fā)育、調(diào)節(jié)與功能相關(guān)的多種蛋白表達與分布差異.首次通過建立輸精管結(jié)扎和輸出小管結(jié)扎動物模型,模擬生精小管、輸出小管、附睪管因通道阻塞引起的上皮繼發(fā)損傷,并與K

4、0小鼠比較形態(tài)學(xué)差異本組研究發(fā)現(xiàn)在不同生長時期GPR48/LGR4KO小鼠體重為對照的55﹪-80﹪,體長為對照的60﹪-90﹪,均明顯低于同窩對照WT小鼠(ANOVA,P(0.01). GPR48/LGR4 K0小鼠三周存活率為32.4﹪,KO胚鼠肺泡間隔較WT鼠明顯增厚,肺泡含氣量減少.KO小鼠相對體重的尿量和飲水量分別是WT對照的2.2和1.8倍,顯著高于野生型對照(非參檢驗,P<0.001,P=0.02).雄性KO小鼠不育,雌性

5、KO小鼠生育率低.KO小鼠睪丸和附睪相對體重比值是同窩對照WT組的260﹪和15﹪,差異顯著(非參檢驗,P<0.001).K0小鼠睪丸高度腫脹畸形,附睪發(fā)育不良.組織學(xué)顯示:KO小鼠睪丸網(wǎng)、直精小管、生精小管擴張,管腔見較多肉芽腫樣再生物附著于上皮,生精上皮明顯變薄；輸出小管和附睪管數(shù)目明顯減少,管腔高度擴張,管腔中有多個肉芽腫樣物質(zhì)贅生；輸出小管和附睪管頭、體部上皮高度變矮,纖毛明顯減少,部分上皮細胞變性脫落；管周間質(zhì)明顯增生,膠原纖

6、維增多.多數(shù)附睪管的體、尾部均未見精子；附睪管管腔內(nèi)呈PAS染色強陽性,附睪上皮細胞胞質(zhì)中PAS染色陽性顆粒增多,基膜增厚.電鏡觀察首次發(fā)現(xiàn)KO小鼠生精細胞出現(xiàn)大量空泡,精子變形,尾部9+2微管結(jié)構(gòu)異常.支持細胞細胞收縮,體積變小,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,線粒體腫脹變形,形成空泡樣結(jié)構(gòu),核固縮,支持細胞與周圍各級生精細胞間隙變大,各級生精細胞脫落,部分生精上皮僅剩下支持細胞.附睪管上皮基底膜明顯增寬,形態(tài)不規(guī)整.附睪尾部亮細胞增多,胞內(nèi)吞飲小泡和溶

7、酶體樣顆粒形態(tài)異常.RT-PCR證實GPR48/LGR4mRNA在睪丸、附睪、腎上腺、垂體、下丘腦等組織廣泛表達,首次發(fā)現(xiàn)睪丸組織GPR48/LGR4mRNA表達量隨小鼠年齡增加而增加.原位雜交顯示GPR48/LGR4mRNA在睪丸、輸出小管和附睪上皮分布廣泛,LacZ染色顯示GPR48/LGR4:蛋白在睪丸和附睪均表達.KO和WT小鼠血漿FSH、LH、T水平無顯著性差異.酶標(biāo)免疫組化和熒光免疫組化方法發(fā)現(xiàn)KO小鼠輸出小管和附睪管上皮細

8、胞的雌激素受體α(ERα)、雌激素相關(guān)受體α(ERRα)、雄激素受體(AR)、水通道蛋白9(AQP9)、鈉鉀ATP酶α亞單位(Na-K-ATPase)、鈉氫交換器3(NHE3)表達明顯降低.上皮細胞間粘著連接標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin表達無明顯改變.KO小鼠輸出小管細胞核增殖抗原 (PCNA) 表達明顯降低.輸精管結(jié)扎和輸出小管結(jié)扎小鼠因通道阻塞引起的生精上皮繼發(fā)損傷改變與KO小鼠相似,輸出小管和附睪管上皮變化與KO