多種細(xì)胞體系Gq蛋白偶聯(lián)受體和IP3受體偶聯(lián)的研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是目前已發(fā)現(xiàn)受體中種類最多的一類。這些受體在結(jié)構(gòu)上有很大的相似性，由一條肽鏈形成，跨膜七次，N端在胞外，C端在胞內(nèi)。這些受體與效應(yīng)器間都通過G蛋白介導(dǎo)。G蛋白種類較多，但所有類型G蛋白都由3個不同的亞單位即a、β、γ所組成，a亞單位具有特異的GTP結(jié)合位點，有G3、P酶活性。根據(jù)G蛋白的a亞單位的結(jié)構(gòu)，可將其分為6個亞家族：G<,s>，G<,i/o>，G<,q>，G<,t>，G<,g>和G<,12><'[1]>

2、。由G<,q>蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的磷脂酶C(PLC)信號系統(tǒng)是一種廣泛存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。G<,aq>蛋白激活后首先激活PLCB，進而水解胞膜PIP<,2>，水解生成兩種第二信使IP<,3>與DAG，進而調(diào)控諸多細(xì)胞功能，例如離子通道功能、細(xì)胞周期、腺體分泌，等等。 IP<,3>受體廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，它是一種能引發(fā)內(nèi)鈣釋放的通道蛋白，能與IP<,3>結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，導(dǎo)致內(nèi)鈣水平的升高，從而啟動細(xì)胞內(nèi)鈣信號系統(tǒng)，通過

3、依賴鈣離子的鈣調(diào)素等酶類活性的變化來調(diào)控一系列的生理過程。到目前為止，共有四種IP<,3>受體被發(fā)現(xiàn)，其中，Ⅰ型受體廣泛存在于神經(jīng)組織中。細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要的作用。另外，鈣信號的異常也參與了諸多病理過程中。 M 電流是在1980年由Brown和Admas在牛蛙的頸上交感神經(jīng)節(jié)被首次發(fā)現(xiàn)，它是一種慢激活，非失活的電壓依賴性外向鉀離子電流，因其可被毒蕈堿受體強烈抑制而得名。自1998年以來人們逐漸認(rèn)識到其分子

4、基礎(chǔ)是KCNQ家族(KCNQ2/3)的鉀離子通道。M電流與神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性密切相關(guān)。自電流被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在20多年的時間里，人們對其調(diào)節(jié)機制做了大量深入的研究，目前已發(fā)現(xiàn)許多于G<,q>蛋白偶聯(lián)的受體激活后均能引起M電流的抑制，并且膜磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP<,2>)參與了膜受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已證實G<,q>蛋白偶聯(lián)受體激活后，都會引起位于胞膜內(nèi)側(cè)的PIP<,2>水解，產(chǎn)生IP<,3>和DAG。已有的研究結(jié)果證實M<,1>受體的激活引起

5、M電流的抑制是由于PIP<,2>的水解所為，而另外一種受體BK<,2>受體激活后雖然也產(chǎn)生IP<,3>和DAG，但它激活后所引起的M電流抑制是通過鈣離子介導(dǎo)，由鈣調(diào)素來實現(xiàn)的。同樣是利用PLC信號通路的M<,1>受體和BK<,2>受體為何會分別利用PIP<,2>和鈣離子來實現(xiàn)對M電流的調(diào)控?因此，目前對于這一問題有人提出了用微域結(jié)構(gòu)來解釋這種信號傳導(dǎo)的特異性，他們認(rèn)為BK<,2>受體與IP<,3>受體處于同一個微域結(jié)構(gòu)內(nèi)，因此BK<,2

6、>受體激活后所產(chǎn)生的IP<,3>能以較大濃度作用于附近的IP<,3>受體，進而引起細(xì)胞內(nèi)鈣釋放；而M受體和IP<,3>受體卻沒有形成相應(yīng)的微域結(jié)構(gòu)，因此其激活后所產(chǎn)生的IP<,3>在局部不能形成使IP<,3>受體激活的有效濃度，從而不能引起細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放。上述實驗結(jié)論是建立在以大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)為研究的基礎(chǔ)上而得出的。眾所周知，磷脂酶C信號通路是一種廣泛存在于眾多生命形式中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。因此，這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異性在其他的神經(jīng)細(xì)胞是否存

7、在還不得而知。這一問題的闡明，將對深入了解磷脂酶C信號通路的多樣性具有至關(guān)重要的意義。本小組前期的研究結(jié)果表明：在不同的神經(jīng)細(xì)胞中，M<,1>，BK<,2>，H<,1>，AT<,1>受體激活后雖然都可以水解PIP<,2>，產(chǎn)生IP<,3>和DAG，但是引發(fā)內(nèi)鈣釋放的作用之間存在明顯不同，在頸上神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)BK<,2>，H<,1>，AT<,1>受體激活后均可以引起內(nèi)鈣的升高，而M<,1>受體則不能。在海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，BK<,2>，H<,1

8、>，M<,1>受體激動后引起內(nèi)鈣升高，而AT<,1>受體則不能。在HEK293細(xì)胞內(nèi)，過表達M<,1>和BK<,2>受體引起的內(nèi)鈣釋放與神經(jīng)細(xì)胞又有所不同，二者均可以引起內(nèi)鈣升高。在爪蟾卵母細(xì)胞過表達M<,1>和BK<,2>受體也均可以引起內(nèi)鈣的升高。本實驗以大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、海馬神經(jīng)元、HEK293細(xì)胞、爪蟾卵母細(xì)胞為研究對象，利用免疫共沉淀技術(shù)觀察不同G<,q>蛋白偶聯(lián)受體和位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IP<,3>受體之間的關(guān)系，探究是否存

9、在一種信號微域以及其特點，從而為G<,q>蛋白偶聯(lián)受體的信號通路的多樣性尋找生化依據(jù)。 目的： 利用免疫共沉淀技術(shù)，在兩種不同類型的神經(jīng)細(xì)胞、HEK293細(xì)胞以及爪蟾卵母細(xì)胞，觀察不同G<,q>蛋白偶聯(lián)受體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP<,3>受體之間的關(guān)系。 方法： 采用免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)，SDS-PAGE，Western blot等方法觀察在頸上交感神經(jīng)節(jié)和海馬神經(jīng)元中上述四種G<

10、,q>蛋白偶聯(lián)受體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP<,3>受體之間的關(guān)系。在HEK293細(xì)胞中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法外源性表達M<,1>、H<,1>、AT<,1>、：BK<,2>受體，觀察這四種受體與IP<,3>受體的關(guān)系。在爪蟾卵母細(xì)胞中，利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA在卵母細(xì)胞外源性表達M<,1>和BK<,2>受體，觀察這兩種受體與IP<,3>受體之間的關(guān)系。 結(jié)果： (1)在頸上神經(jīng)節(jié)和海馬神經(jīng)元中，均可檢測到M<,1>、H<,1>、AT<,1

11、>、BK<,2>受體的表達。(2)在頸上神經(jīng)節(jié)和海馬神經(jīng)元中，均可檢測到IP<,3>受體的表達。(3)免疫共沉淀的結(jié)果表明，在頸上交感神經(jīng)節(jié)中，H<,1>、AT<,1>、BK<,2>受體均可以和IP<,3>受體共沉淀，未發(fā)現(xiàn)M<,1>和IP<,3>受體共沉淀。在海馬神經(jīng)元，AT<,1>受體可以和IP<,3>受體共沉淀，未發(fā)現(xiàn)M<,1>、H<,1>、BK<,2>受體和IP<,3>受體共沉淀。(4)在分別外源性表達M<,1>、H<,1>、A

12、T<,1>、BK<,1>受體的HEK293細(xì)胞中，均可以分別檢測到四種受體的表達。(5)在外源性表達這四種受體的HEK293細(xì)胞中，均可以檢測到IP<,3>受體的表達。(6)在過表達這四種受體的細(xì)胞中，M<,1>、BK<,2>、AT<,1>與IP<,3>受體共沉淀，而H<,1>受體不能與IP<,3>受體共沉淀。(7)在過表達M<,1>和BK<,2>受體的爪蟾卵母細(xì)胞中，均可以檢測到這兩種受體的過表達。(8)在過表達M<,1>和BK<,2

13、>受體的爪蟾卵母細(xì)胞中，均可以檢測到IP<,3>受體的表達。(9)在爪蟾卵母細(xì)胞中，這兩種受體均可以和IP<,3>受體共沉淀。 結(jié)論： (1) 在大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中中，M<,1>受體和H<,1>、AT<,1>、BK<,2>受體與IP<,1>受體之間的關(guān)系不同，其中，H<,1>、AT<,1>、BK<,1>受體與IP<,1>受體相偶連，而M<,1>和IP<,3>受體之間不存在偶連關(guān)系。在海馬神經(jīng)元中，AT<,1>和IP

14、<,3>受體相偶連，M<,1>、BK<,2>、H<,1>受體和IP<,3>受體之間不存在偶連關(guān)系。(2)在HEK293細(xì)胞中，M<,1>、H<,1>、AT<,1>、BK<,2>受體與IP<,3>受體之間存在偶連關(guān)系，與神經(jīng)組織存在明顯不同。(3)在爪蟾卵母細(xì)胞中，M<,1>和BK<,1>受體與IP<,1>受體之間存在偶聯(lián)關(guān)系，與HEK293細(xì)胞中的結(jié)果一致。(4)不同組織細(xì)胞中不同GPCR與IP<,3>受體偶聯(lián)有較大差異，其細(xì)胞生理學(xué)意