多種Gq蛋白偶聯(lián)受體激活后對KCNQ-M電流的作用及機制的研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled-receptors，GPCRs)是目前發(fā)現(xiàn)的最大的細(xì)胞膜表面受體超家族，具有重要的生理病理學(xué)和藥理學(xué)意義。其獨特的結(jié)構(gòu)特征和在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用決定了其可以作為很好的藥物靶點。GPCRs特異性的激動劑及阻斷劑具有良好的藥物開發(fā)前景。事實上目前市場上超過一半的藥物均是以GPCRs為靶點的。不同的GPCR通過和相應(yīng)的G蛋白(G protein)偶聯(lián)可以對細(xì)胞外多種刺激信號作出反應(yīng)，在細(xì)胞

2、內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)傳遞、味覺、嗅覺、視覺及細(xì)胞的新陳代謝、分化、增殖、分泌等一系列生理效應(yīng)。G蛋白種類較多，但所有類型G蛋白都由3個不同的亞單位即α、β、γ所組成。α亞單位具有特異的GTP結(jié)合位點，有GTP酶活性。根據(jù)G蛋白的α亞單位的結(jié)構(gòu)，可將其分為4個亞家族：Gs，Gi/o，Gq和G12。 M電流最早于1980年由Brown和Admas在牛蛙頸上交感神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)，是一種慢激活、非失活的電壓依賴型外向鉀離子電流，因其可被激活后的毒蕈堿

3、受體(M受體)所抑制而得名。M電流的抑制將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)興奮性升高。M通道的功能失調(diào)與良性家族性新生兒驚厥癥(BFNCs)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer)、癲癇等疾病密切相關(guān)。M通道的分子基礎(chǔ)是KCNQ鉀離子通道，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種KCNQ亞型：KCNQ1～5，其中KCNQ2-5，尤其是KCNQ2/Q3參與構(gòu)成M電流。在對M電流調(diào)節(jié)機制的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些Gq蛋白偶聯(lián)受體激活后能引起M電流的抑制。由Gq蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的磷脂酶C(P

4、LC)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是其抑制M電流的主要途徑。目前已證明，Gaq蛋白激活后首先激活PLCβ，進而水解胞膜PIP2，PIP2水解生成兩種第二信使IP3與DAG，IP3可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放，而DAG則進一步激活PKC。PIP2水解、PKC及細(xì)胞內(nèi)鈣離子均可能在GPCRs調(diào)節(jié)M電流過程中發(fā)揮了作用。然而，對于是否所有Ga蛋白偶聯(lián)受體激活對KCNQ/M電流的調(diào)節(jié)作用是否利用同樣的機制還不甚明了。 目的：觀察HEK293細(xì)胞中外源

5、性表達的組胺(H1)、血管緊張素Ⅱ(AT1)、嘌呤(P2Y1和P2Y2)受體對共表達的KCNQ2/3通道電流的抑制作用，以細(xì)胞膜PIP2及細(xì)胞內(nèi)鈣釋放為主要觀察點，研究抑制作用的信號通路機制，并為以后的實驗打下基礎(chǔ)。 方法：用全細(xì)胞膜片鉗記錄電流變化：用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀測細(xì)胞膜PIP2敏感熒光探針(PLC -PH-GFP)在細(xì)胞膜與細(xì)胞漿問的轉(zhuǎn)位情況，進而了解PIP2的水解情況；用LSCM及雙波長比例法鈣成像技術(shù)測

6、定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。 結(jié)果： (1)用全細(xì)胞膜片鉗方法記錄到的HEK293細(xì)胞表達的外源性的KCNQ2/3電流可以被共表達的H1、AT1、P2Y1和P2Y2受體激活后所抑制，H1、AT1、P2Y1和P2Y2激活對KCNQ2/3電流的抑制率分別為87.7％±6.9％(n=7)，55.0％±4.9％(n=4)，57.7％±5.1％(n=6)和62.0％±3.1％(n=6)。 (2)LSCM觀察HEK293細(xì)胞膜P

7、IP2水解情況：以上四種受體激動后均可明顯見到熒光探針(PLC -PH-GFP)從胞膜處向胞漿處的轉(zhuǎn)位，洗掉受體激動藥物后，熒光探針又重新由胞漿轉(zhuǎn)位到胞膜(復(fù)位)，呈現(xiàn)一種可逆性變化。在P14激酶抑制劑wortmannin持續(xù)存在的情況下，熒光探針由胞漿到胞膜的復(fù)位被抑制，說明熒光探針的復(fù)位是P14激酶介導(dǎo)的PIP2的再合成的結(jié)果。用PLC阻斷劑U73122預(yù)先孵育細(xì)胞后，受體激活導(dǎo)致的由胞膜向胞漿的熒光轉(zhuǎn)位不再發(fā)生，說明受體激活導(dǎo)致的

8、熒光探針轉(zhuǎn)位是PLC介導(dǎo)的PIP2水解的結(jié)果。 (3)用LSCM及雙波長比例法鈣成像技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化：以上四種受體激動后無論是否有無外鈣存在，均可引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高，這種作用可被U73122阻斷。 (4)組胺H1受體激動后抑制KCNQ2/3電流機制的研究：用全細(xì)胞膜片鉗方法記錄HEK293細(xì)胞表達的KCNQ2/3電流，觀察激活表達的H1受體對KCNQ2/3電流抑制作用，并觀察PLC阻斷劑U-73122、PI4激

9、酶阻斷劑wortmannin和鈣庫耗竭劑thapsigargin對上述作用的影響，從而推斷PIP2及細(xì)胞內(nèi)鈣在H1受體激活抑制KCNQ2/3電流中的作用。PLC阻斷劑U73122可使電流抑制率由74.5±0.6％(n=5)顯著下降到7.14±0.6％(n=5，p＜0.01)，基本取消了H1受體激活對電流的抑制作用，說明H1受體是通過激活PLC對KCNQ2/3電流產(chǎn)生抑制的：P14激酶抑制劑wortmannin使電流被抑制后的恢復(fù)率由88

10、.4±6.2％(n=7)顯著下降到10.5±3.4％(n=8，p＜0.01)，說明PIP2的再合成是組胺通過H1受體抑制KCNQ2/3電流后電流恢復(fù)的必要條件：內(nèi)鈣庫耗竭劑thapsigargin應(yīng)用前后電流抑制率分別為90.0±1.6％(n=6)，88.6±3.9％(n=6，p＞0.05)，無顯著性差別，說明細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放沒有參與組胺H1受體抑制KCNQ2/3電流的過程。 結(jié)論：結(jié)果表明在HEK293細(xì)胞中，H1、AT1、P2