慢性應(yīng)激抑郁大鼠FGF2和VEGF表達(dá)以及相互作用.pdf

1、抑郁癥是一種發(fā)生率高、易復(fù)發(fā)、危害大的精神障礙，以持續(xù)的情緒低落和認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征。近年來(lái)隨著發(fā)病率不斷增高而引起人們廣泛關(guān)注，但其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，至今尚未完全闡明[1]。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factor，NTFs)、神經(jīng)可塑性改變等因素與抑郁癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。這對(duì)揭示抑郁癥發(fā)病機(jī)制并為其防治提供新思路和途徑。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類活性蛋白質(zhì)，主要由神經(jīng)元支配的靶組織或膠質(zhì)細(xì)胞

2、產(chǎn)生，能夠促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)分化、生長(zhǎng)和存活并對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有營(yíng)養(yǎng)作用。這些小分子蛋白質(zhì)具有55%～65%相同的氨基酸序列，并在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持正常生理功能中起著重要作用。學(xué)者在2006年提出了“抑郁癥的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)”(Neurotrophinhypothesis of depression)。該假說(shuō)認(rèn)為，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有促進(jìn)突觸生長(zhǎng)、維持神經(jīng)元生存的作用，如果前額葉、海馬等腦區(qū)缺少神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子則相應(yīng)腦功能會(huì)受到抑制最終導(dǎo)致抑

3、郁；而抗抑郁藥物則是通過(guò)增加腦中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量、提高突觸的可塑性和促進(jìn)神經(jīng)元的生存來(lái)發(fā)揮其治療抑郁的效果。即神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水平下降參與了抑郁癥的病理生理過(guò)程。
　　 在抑郁癥的候選基因研究中，F(xiàn)GF2和VEGF與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和再生、神經(jīng)可塑性改變等現(xiàn)象存在關(guān)聯(lián)，因此受到廣泛的關(guān)注。FGF2是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員，具有促進(jìn)神經(jīng)組織損傷修復(fù)、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。成人大腦中的FGF2可促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)，在神經(jīng)發(fā)生的早期就

4、起到了一定作用[2]。研究表明FGF2與抑郁癥密切相關(guān)，主要有如下幾方面的依據(jù)：(1)國(guó)外尸解研究表明：抑郁患者前額葉皮質(zhì)和海馬FGF2 mRNA表達(dá)總量降低(在CA1區(qū)、CA4區(qū)表達(dá)低于齒狀回)，且海馬FGF2神經(jīng)元減少[3]。(2)抗抑郁藥物研究：研究證實(shí)使用抗抑郁藥物治療后，前額葉的FGF2表達(dá)增加[4]。(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究：Perez等通過(guò)檢測(cè)小鼠體內(nèi)FGF2，發(fā)現(xiàn)FGF2水平的高低與小鼠抑郁程度直接相關(guān)，而環(huán)境強(qiáng)化可降低抑郁程

5、度。以上研究綜合顯示FGF2可能參與了多種生理過(guò)程而影響抑郁癥。
　　 VEGF又稱為血管生成因子，可以有效地促進(jìn)血管再生以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。國(guó)外學(xué)者研究表明：抑郁癥患者急性發(fā)作期，VEGF的水平有所增加[5]。不僅如此，VEGF能夠通過(guò)刺激血管再生，保護(hù)缺血和退變的神經(jīng)元，引發(fā)成年大腦神經(jīng)元的再生，從而影響抑郁。其依據(jù)主要有如下幾方面：(1)基因多態(tài)性相關(guān)研究：2010年Viikki等對(duì)VEGF基因多態(tài)性與抗抑郁治療之間的關(guān)聯(lián)

6、進(jìn)行了研究，他們選取了119名被試采用電驚厥療法、8名被試采用了五羥色胺重吸收抑制(serotonin selective reuptake inhibitors，SSRI)療法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF2578 C/A位點(diǎn)在兩種療法后表達(dá)均有改變。(2)抗抑郁藥物研究：研究使用多種抗抑郁藥物以評(píng)價(jià)其效果，發(fā)現(xiàn)在側(cè)腦室注射VEGF增加大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的同時(shí)，能產(chǎn)生抗抑郁樣行為；而注射VEGF受體拮抗劑SU5416可以抵消VEGF介導(dǎo)的海馬

7、細(xì)胞增殖反應(yīng)及抗抑郁效果。(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究：VEGF可以刺激SGZ區(qū)的細(xì)胞增殖并在動(dòng)物模型的行為評(píng)定中產(chǎn)生類似抗抑郁藥的效果，阻斷VEGF，這種效果則被抑制。上述研究表明，VEGF可能與抗抑郁作用有所關(guān)聯(lián)。
　　 綜上，F(xiàn)GF2和VEGF均與抑郁癥存在一定關(guān)聯(lián)，二者的生物學(xué)功能也有一定相通之處，那么二者是否能夠共同介導(dǎo)抑郁？抑郁癥的神經(jīng)可塑性假說(shuō)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)認(rèn)為，抑郁癥發(fā)生和痊愈過(guò)程中海馬等腦結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)顯著的功能和形態(tài)變化。

8、應(yīng)激或抑郁癥會(huì)導(dǎo)致海馬、前額葉與杏仁核等邊緣區(qū)神經(jīng)元萎縮和細(xì)胞丟失，并且引起神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)下降；使用抗抑郁藥物會(huì)促進(jìn)成年海馬神經(jīng)再生以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)增加，相應(yīng)的增加成年海馬神經(jīng)發(fā)生以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)能夠產(chǎn)生抗抑郁作用。目前研究結(jié)果顯示抑郁癥患者腦結(jié)構(gòu)和功能改變主要在前額葉皮質(zhì)、海馬、杏仁核等主要靶器官[6]，是應(yīng)激性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)中樞和神經(jīng)可塑性的腦區(qū)[7]。綜合分析抗抑郁機(jī)制，其關(guān)鍵可能在于是否能夠誘導(dǎo)成年海馬神經(jīng)發(fā)生以及神

9、經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)增加，類似于藥物的抗抑郁治療作用[8]。據(jù)此，理論上可以通過(guò)調(diào)控相應(yīng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)來(lái)治療抑郁，但是FGF2和VEGF都是大分子，其單獨(dú)作用時(shí)很難通過(guò)血腦屏障直接影響神經(jīng)發(fā)生。且FGF2和VEGF單獨(dú)作用時(shí)只能對(duì)抑郁癥的部分生理機(jī)制作出解釋。VEGF具有增加血管生成而影響神經(jīng)發(fā)生的作用，F(xiàn)GF2也可通過(guò)神經(jīng)保護(hù)作用或增加血管生成作用來(lái)提高神經(jīng)系統(tǒng)的功能。那么當(dāng)二者聯(lián)合作用時(shí)是否可能通過(guò)血管生成而達(dá)到增加神經(jīng)再生的作用？雖

10、然FGF2、VEGF的生物學(xué)作用不同，但是功能互補(bǔ)甚至重疊，可能共同調(diào)控下游的信號(hào)傳導(dǎo)以及基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，在抗抑郁過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此，本研究擬從分子及蛋白水平研究FGF2和VEGF在海馬以及前額葉皮質(zhì)層的表達(dá)，并且對(duì)二者的在海馬中的相互作用加以探討。
　　 方法：
　　 1.采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激法(chronic Unpredietable mild stress，CUMS)建立抑郁癥大鼠模型，運(yùn)用敞箱實(shí)驗(yàn)(Ope

11、n-field behavior)，測(cè)量糖水消耗量和攝食量及體重增量三種指標(biāo)檢測(cè)模型是否成功建立。
　　 2.在模型成功建立的基礎(chǔ)上，將大鼠分為抑郁組以及對(duì)照組。運(yùn)用免疫印記法(western-blot，WB)、熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qreal-time PCR)檢測(cè)CUMS大鼠海馬腦區(qū)和前額皮質(zhì)層FGF2和VEGF表達(dá)。
　　 3.探討FGF2和VEGF的相互作用：將64只大鼠隨機(jī)分為以下8組：A空白對(duì)照組：對(duì)照組注射生

12、理鹽水；B抑郁對(duì)照組：抑郁組注射生理鹽水；C SU5402空白組：空白組注射SU5402；D SU5416空白組：空白組注射SU5416；E SU5402抑郁組：抑郁組注射SU5402；F SU5416抑郁組：抑郁組注射SU5416；G SU5402+SU5416組：抑郁組注射SU5402+SU5416；H SU5416+SU5402組：抑郁組注射SU5416+SU5402。采用免疫組化法觀測(cè)FGF2和VEGF的形態(tài)學(xué)改變，并采用液體消

13、耗實(shí)驗(yàn)、敞箱實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳等方法觀測(cè)動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)。
　　 結(jié)果：
　　 實(shí)驗(yàn)一結(jié)果：通過(guò)28天的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，并采用測(cè)量攝食量及體重增量，糖水消耗量實(shí)驗(yàn)以及敞箱實(shí)驗(yàn)三種方法對(duì)模型的有效性進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，抑郁組體重增量(94.61±2.37 g)顯著低于對(duì)照組(142.22±3.09 g)(P<0.05)，糖水消耗實(shí)驗(yàn)中，抑郁組大鼠蔗糖的消耗量(51.05±0.39 ml)顯著低于

14、對(duì)照組(73.98±0.37 ml)(P<0.05)，敞箱實(shí)驗(yàn)中，抑郁組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)得分(10.80±0.94)、垂直運(yùn)動(dòng)得分(6.04±0.49)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。上述結(jié)果表明慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型已成功建立。
　　 實(shí)驗(yàn)二結(jié)果：western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑郁組大鼠海馬腦區(qū)和前額皮質(zhì)層FGF2和VEGF蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均發(fā)生了顯著下調(diào)(P<0.05)；real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑郁組大

15、鼠海馬腦區(qū)和前額皮質(zhì)層FGF2和VEGF mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比均發(fā)生了顯著下調(diào)(P<0.05)，與western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：FGF2和VEGF在慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型中發(fā)生下調(diào)，二者可能在抑郁癥的發(fā)病機(jī)理中起到了一定作用。
　　 實(shí)驗(yàn)三結(jié)果：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在注射SU5402以及SU516后，糖水消耗實(shí)驗(yàn)，敝箱實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)顯著的抑郁樣行為(P<0.05)；生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：免疫

16、組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射SU5402以及SU516后，各組大鼠的FGF2，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)發(fā)生不同程度的下降。上述結(jié)果提示：FGF2通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)，拮抗慢性應(yīng)激引發(fā)的抑郁行為，共同介導(dǎo)抑郁。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立了CUMS大鼠模型，經(jīng)過(guò)21天的慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激，通過(guò)觀察大鼠一般情況，以及敞箱實(shí)驗(yàn)，糖水消耗量和攝食量及體重增量三種評(píng)價(jià)指標(biāo)檢測(cè)證實(shí)：該模型不僅能夠模擬人類抑郁癥的諸多癥狀，而且操作簡(jiǎn)便，

17、可重復(fù)。是較為理想的抑郁動(dòng)物模型，為以后的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　 2.FGF2和VEGF在CUMS模型的海馬以及前額葉皮質(zhì)層均發(fā)生了顯著下調(diào)。提示上述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在抑郁癥的發(fā)病機(jī)理中起到一定作用，其機(jī)制可能是二者通過(guò)參與神經(jīng)可塑性以及血管生成等生理過(guò)程來(lái)影響抑郁癥的發(fā)生以及發(fā)展。
　　 3.FGF2和VEGF在CUMS模型的海馬存在著相互作用調(diào)節(jié)抑郁癥的共同基礎(chǔ)。FGF2能上調(diào)VEGF的表達(dá)，二者共同發(fā)揮抗抑郁的作用。其機(jī)