高表達(dá)的Hi-FGF2與B23相互作用影響Akt活化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：探討高分子量的堿性成纖維細(xì)胞生長因子（hi-FGF2）在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)后是否導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且其作用機制是否與B23相互作用后影響細(xì)胞中Akt的活化有關(guān)。
　　方法：
　　1.構(gòu)建pDsRed1-N1真核表達(dá)載體：采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，及膠純化回收試劑盒進行DNA提取，質(zhì)粒小提去內(nèi)毒素試劑盒提純擴增。
　　2.空載體pDsRed1-N1質(zhì)粒的鑒定：采用雙酶切法和瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
　　3.

2、質(zhì)粒hi-FGF2-pDsRed1-N1的鑒定：采用PCR擴增DNA片段法和瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
　　4.在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)hi-FGF2：采用瞬時轉(zhuǎn)染法，熒光倒置顯微鏡觀察hi-FGF2的轉(zhuǎn)染效率。
　　5. Western-blot法測定HEK293細(xì)胞中hi-FGF2過表達(dá)后的蛋白水平。
　　6. Western-blot法測定過表達(dá)hi-FGF2的HEK293細(xì)胞中p-Akt的蛋白水平。
　　

3、7.檢測過表達(dá)的hi-FGF2與B23的相互作用：采用免疫共沉淀法。
　　8.檢測細(xì)胞凋亡：采用Annexin V-FITC/PI雙染法，流式細(xì)胞儀（FCM）觀察分析凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建pDsRed1-N1真核表達(dá)載體。
　　2.空載體pDsRed1-N1鑒定正確。
　　3.質(zhì)粒hi-FGF2-pDsRed1-N1鑒定正確。
　　4.成功轉(zhuǎn)染hi-FGF2到HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染

4、效率目測達(dá)到70％以上。
　　5.成功轉(zhuǎn)染后hi-FGF2蛋白表達(dá)水平在50kDa左右。
　　6.過表達(dá)hi-FGF2的HEK293細(xì)胞中p-Akt蛋白水平下降。
　　7.過表達(dá)的hi-FGF2能夠與B23相互作用。
　　8.過表達(dá)hi-FGF2后細(xì)胞凋亡明顯增加。
　　結(jié)論：
　　Hi-FGF2在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其作用機制可能是FGF2過表達(dá)后通過與B23相互作用，下調(diào)p-A