新一代腫瘤條件復(fù)制腺病毒構(gòu)建及其喉癌生物治療研究.pdf

1、凋亡抑制因子（survivin）屬凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成員，由142個(gè)氨基酸組成，通過抑制Caspase3、Caspase7活性抑制細(xì)胞凋亡，并通過與微管、紡錘體作用調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂。hTERT基因是編碼人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶基因，調(diào)節(jié)端粒酶活性的關(guān)鍵基因。Survivin和hTERT基因選擇性地在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)而在正常成熟組織中不表達(dá)。我們在前期實(shí)驗(yàn)中成功克隆了survi

2、vin及hTERT啟動子基因，經(jīng)pGL3-Basic熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體證實(shí)，該兩個(gè)啟動子能高特異性地在腫瘤細(xì)胞中調(diào)控下游基因表達(dá)，其活性甚至高于CMV啟動子。survivin及hTERT基因啟動子高活性及惡性腫瘤表達(dá)譜廣泛性，使其更適合于構(gòu)建腫瘤特異性復(fù)制腺病毒（Tumour-Selectively Replicating Oncolytic Adenovirus，T-SROAd）。因此，我們擬通過雙啟動子（survivin和hT

3、ERT啟動子）分別調(diào)控腺病毒復(fù)制必需基因E1A及E1B的表達(dá)，并攜帶蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(Protein Transduction Domain,PTD)和野生型p53融合基因，構(gòu)建新一代的T-SROAd。
　　目的：
　　通過構(gòu)建和包裝雙啟動子（survivin和hTERT啟動子）調(diào)控的腺病毒復(fù)制必需基因E1A及E1B的表達(dá)，并攜帶蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)和野生型p53融合基因的重組腺病毒，為喉癌乃至所有survivin及hTERT高表

4、達(dá)的惡性腫瘤探索出一種新的、療效更高、毒副作用更低并適用于轉(zhuǎn)移瘤的生物治療新方法
　　方法：
　　(1)PCR方法分別擴(kuò)增腫瘤特異性survivin及hTERT啟動子，并克隆入腺病毒載體pXC1的兩個(gè)復(fù)制必需基因E1A和E1B序列上游啟動子區(qū)，hTERT啟動子同時(shí)調(diào)控PTD-P53及IRES連接的E1B基因，即HP-PTDP53-IRES融合基因，構(gòu)建出雙腫瘤特異性啟動子調(diào)控的條件復(fù)制腺病毒載體pXC1-SP-HP53；

5、r>　　(2)重組腺病毒載體與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞進(jìn)行同源重組，空斑技術(shù)獲取病毒，并進(jìn)行病毒擴(kuò)增、純化、滴度測定及遺傳穩(wěn)定性鑒定，將病毒命名為Ad-SP-HP53；
　　(3)重組腺病毒Ad-SP-HP53感染人喉癌細(xì)胞Hep-2，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，MTT檢測方法觀察其對喉癌細(xì)胞Hep-2的特異性溶瘤作用，并以正常人的血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304作為對照。流式細(xì)胞術(shù)及AO/EB染色檢

6、測重組腺病毒感染后Hep-2細(xì)胞凋亡；
　　(4)裸鼠體內(nèi)注射Hep-2細(xì)胞成瘤后，瘤體注射Ad-SP-HP53，觀察其對腫瘤的生長抑制作用。
　　結(jié)果：
　　(1)限制性酶切及測序方法鑒定結(jié)果證實(shí)，成功構(gòu)建了雙腫瘤特異性啟動子調(diào)控的復(fù)制腺病毒載體pXC1-SP-HP53；
　　(2)同源重組獲得高滴度重組腺病毒，滴度為3.9×1010TCID50/ml。重組腺病毒遺傳穩(wěn)定性較好，經(jīng)RT-PCR分析重組病毒感染的

7、Hep-2細(xì)胞顯示，目的基因在Hep-2細(xì)胞中呈陽性表達(dá)；
　　(3)MTT結(jié)果顯示，Ad-SP-HP53可有效抑制喉癌細(xì)胞增殖而對正常細(xì)胞無增殖抑制作用（p<0.05）；活細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，重組腺病毒在喉癌細(xì)胞中選擇性復(fù)制并發(fā)揮溶細(xì)胞作用；流式細(xì)胞術(shù)及凋亡染色顯示，Ad-SP-HP53可有效促進(jìn)Hep-2的凋亡；
　　(4)裸鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)顯示，構(gòu)建的重組腺病毒Ad-SP-HP53可有效抑制腫瘤生長，延長裸鼠