信號(hào)選擇性甲狀旁腺素模擬肽影響去勢(shì)雄性小鼠骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 骨質(zhì)疏松癥，顧名思義是骨質(zhì)多孔，以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，骨密度和骨量降低，致使骨的脆性增加，骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥主要分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥兩大類。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查估計(jì)，歐美國(guó)家和日本約有7500萬(wàn)人患骨質(zhì)疏松癥，患病人數(shù)還在不斷的增加。美國(guó)骨質(zhì)疏松雜志基金會(huì)調(diào)查結(jié)果顯示，依據(jù)WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)，絕經(jīng)后白人女性分別有54％和30％患骨量減少和骨質(zhì)疏松，大于50歲

2、男性有3％～6％患骨質(zhì)疏松。據(jù)WHO預(yù)測(cè)，至2050年亞洲65歲以上老年人將達(dá)9億，每年將有320萬(wàn)髖部骨折患者，其中主要原因?yàn)楣橇繙p少和骨質(zhì)疏松。隨著我國(guó)人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥現(xiàn)在也成為公共健康最嚴(yán)重的問(wèn)題之一。據(jù)我國(guó)九五攻關(guān)課題調(diào)研結(jié)果發(fā)現(xiàn):中國(guó)人群骨質(zhì)疏松患病率為22.6％，骨量減少患病率為13.3％。骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重后果是骨折以及骨折后并發(fā)癥所致的殘疾和死亡，不僅給患者帶來(lái)痛苦，同時(shí)給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。
　　

3、治療骨質(zhì)疏松的基本方法包括基礎(chǔ)治療和藥物治療。其中，基礎(chǔ)治療包括飲食調(diào)節(jié)、鈣劑和維生素D等。藥物治療以促骨形成、抑制骨吸收為基本原則。目前運(yùn)用于臨床的抗骨吸收的藥物有如雌激素、二磷酸鹽、降鈣素、活性維生素D衍生物等。促骨形成藥物如氟化物、雄性激素及其衍生物、生長(zhǎng)激素、鍶鹽、PTH片段等。增加骨量促骨形成的代謝藥物中，目前僅有甲狀旁腺素(Parathyroid Hormone，PTH)獲得一致認(rèn)可（盡管鍶鹽被認(rèn)為有一定的促骨形成作用，但需

4、要更多的研究證實(shí)）。
　　 甲狀旁腺激素(PTH)是體內(nèi)重要的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑。PTH(1-34)是天然PTH(1-84)的短肽形式，具有相同的結(jié)合能力和相同的電位，激活Ⅰ型的PTH受體(PTHR1)。PTH(1-34)已在美國(guó)上市治療骨質(zhì)疏松，并于2011年10月正式在我國(guó)投入臨床使用。臨床隨訪觀察其具有可靠的抗骨質(zhì)疏松作用，但仍未達(dá)到理想的效果。重要的原因之一是:PTH對(duì)骨組織的作用是雙向的，即間斷小劑量促進(jìn)骨形成，連續(xù)大劑量促

5、進(jìn)骨吸收。PTH可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生成、轉(zhuǎn)化、增殖或凋亡等各個(gè)環(huán)節(jié)，也促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收功能?，F(xiàn)認(rèn)為，PTH對(duì)骨組織的作用主要通過(guò)與成骨系細(xì)胞表面的Ⅰ型PTH受體(PTHR1)結(jié)合，對(duì)破骨細(xì)胞的作用是通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞的影響而間接達(dá)到的。PTH影響骨形成和骨吸收功能與其PTHR1引起的多個(gè)信號(hào)途徑有關(guān)。與PTHR1結(jié)合后，G蛋白偶聯(lián)的cAMP/PKA信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被觸發(fā)，其中包括cAMP/PKA，PLC/PKC和PLC-independen

6、t/PKC通道，每條通道都對(duì)應(yīng)至PTH(1-34)的氨基酸序列的關(guān)鍵性區(qū)域。其中1位絲氨酸對(duì)于PLC的激活是至關(guān)重要的，N末端開始的3個(gè)氨基酸是cAMP/PKA活化所必須的。我們以前的研究證實(shí)，PTH(29-34)對(duì)于PLC-independent/PKC信號(hào)通路非常重要。隨著對(duì)PTH(1-34)信號(hào)通路的認(rèn)識(shí)加深，我們?cè)O(shè)計(jì)出[Gly1，Arg19]hPTH(1-34)是一個(gè)模擬PTH缺乏激活PLC信號(hào)通路的模擬肽，第1位絲氨酸(Ser

7、1)突變成甘氨酸(Gly1)大幅度失去激活PLC信號(hào)的特性。19位谷氨酸突變成精氨酸(Arg19)可以補(bǔ)償29-34氨基酸殘基缺失引起的受體結(jié)合力的減弱。該結(jié)論已經(jīng)通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，間斷小劑量注射PTH及其改建缺陷模擬肽能增加脛骨平臺(tái)下方骨小梁數(shù)量和大小，增加全身骨密度。
　　 PTH(1-34)促進(jìn)骨折愈合的作用已在多篇?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)研究中報(bào)道，如間歇性注射PTH(1-34)可提高骨痂的骨密度和骨形成，促進(jìn)骨折愈合，增加全身骨密度

8、，影響血清成骨標(biāo)志物形成。尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道PTH模擬肽作用于骨折愈合的研究。
　　 雄激素在生物體內(nèi)存在廣泛的生理作用，尤其是在雄性生殖器官的發(fā)育、性成熟和生精功能的維持等方面。其中，雄激素的主要成分為睪酮。有研究報(bào)道睪酮對(duì)于人的骨骼生長(zhǎng)、發(fā)育具有重要影響，但隨著年齡的增加，人體內(nèi)睪酮的濃度逐漸降低，低水平睪酮濃度的老年男性容易導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換加快以及增加骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。低睪酮水平的骨微結(jié)構(gòu)變化及其骨折愈合的情況，以前相關(guān)的研究十分有限。

9、去睪丸動(dòng)物骨折后，運(yùn)用信號(hào)選擇性甲狀旁腺激素模擬肽進(jìn)行干預(yù)，觀察骨折愈合的情況，將有利于了解PTH信號(hào)通路對(duì)于骨折愈合的影響，探討新藥的設(shè)計(jì)及運(yùn)用。
　　 研究目的：
　　 1、通過(guò)建立雄性小鼠睪丸摘除去勢(shì)模型，分析研究小鼠去睪丸后血清雄激素水平變化以及小鼠骨量和骨顯微結(jié)構(gòu)變化。在此基礎(chǔ)上建立股骨骨折模型，觀察去勢(shì)組與對(duì)照組之間骨折愈合情況。
　　 2、觀察甲狀旁腺素(PTH)信號(hào)選擇性模擬肽對(duì)去勢(shì)雄鼠骨折的作用

10、，比較具有不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活特性的PTH模擬肽對(duì)骨折愈合的影響，為PTH促進(jìn)骨折愈合理論研究和新型骨折愈合刺激藥物的發(fā)展提供研究資料。
　　 研究方法：
　　 1、雄性小鼠去勢(shì)模型及股骨骨折模型建立
　　 40只7周齡C57BL/6J雄性小鼠，其中8只作為基線組，余下32只隨機(jī)分為去勢(shì)組與對(duì)照組，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)南方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意。異氟烷氣體(300ml/min)吸入誘導(dǎo)麻醉后，通過(guò)面罩給氧持續(xù)吸入。常規(guī)

11、備皮、皮膚消毒，于陰囊皮膚正中線剪開約1cm，暴露雙側(cè)睪丸、附睪及周圍組織，切除睪丸并縫合陰囊，術(shù)畢皮膚消毒。對(duì)照組行假手術(shù)，切開陰囊皮膚后縫合。去勢(shì)后1周后建立股骨中段骨折模型，異氟烷氣體麻醉后，選擇右側(cè)大腿備皮、皮膚消毒，根據(jù)小鼠股骨骨折模型文獻(xiàn)報(bào)道，于右大腿后外側(cè)作切口，從膝關(guān)節(jié)處逆行插入直徑為0.45mm鋼針進(jìn)行髓內(nèi)固定，鈍性分離肌肉及軟組織，暴露股骨中段，直視下用手術(shù)刀環(huán)形切斷股骨中段部分，造成橫行骨折，逐層縫合肌肉及皮膚，術(shù)

12、畢皮膚消毒。術(shù)后定期觀察傷口愈合情況，所有小鼠均未發(fā)生感染，切口愈合良好。骨折后2周及4周，摘除小鼠眼球取血并分離血清。ELISA法測(cè)量血清雄激素（睪酮）濃度，運(yùn)用顯微CT測(cè)量脛骨平臺(tái)下2mm骨量及骨微結(jié)構(gòu)，骨折愈合情況通過(guò)顯微CT顯示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以((x)±s)表示;組間比較采用采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、信號(hào)選擇性甲狀旁腺素模擬肽

13、對(duì)去勢(shì)小鼠骨折愈合的影響
　　 48只7周齡C57/BL雄性小鼠，摘除睪丸去勢(shì)后1周制作股骨中段骨折模型，術(shù)后隨機(jī)分為3組，每組16只，模型建立后的第2天開始注射hPTH(1-34)(40ug/kg)、PLC信號(hào)缺陷模擬肽G1，R19(1-34)(40ug/kg)和等量的溶解劑。術(shù)后2周和4周，雙能X線骨密度儀測(cè)量骨痂區(qū)骨密度。骨折愈合情況通過(guò)X線、顯微CT、生物力學(xué)和組織學(xué)顯示。
　　 結(jié)果：
　　 1.去勢(shì)后

14、1周，所有小鼠都蜷縮在一起，活動(dòng)緩慢并且減少，其取食飲水與假手術(shù)組基本保持一致。術(shù)后2周（骨折術(shù)后，以下同），對(duì)照組的睪酮濃度為215.83±8.36 ng/L，去勢(shì)組的睪酮濃度為186.16±6.47 ng/L，兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。術(shù)后4周，對(duì)照組的睪酮濃度為224.65±4.51 ng/L，去勢(shì)組的睪酮濃度為94.346±3.96 ng/L，兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)，去勢(shì)組明顯低于對(duì)照組。去勢(shì)后2周，去

15、勢(shì)小鼠脛骨生長(zhǎng)板下2mm處骨小梁減少，骨折處新骨形成較對(duì)照明顯降低(p＜0.05)。BV/TV比例也明顯少于對(duì)照組。4周時(shí)，脛骨生長(zhǎng)板下2mm處骨小梁顯著減少，骨皮質(zhì)變薄，骨折處新骨形成較對(duì)照更明顯降低(p＜0.05），BV/TV比例在對(duì)照組和去勢(shì)組較2周時(shí)增加，但去勢(shì)組較少BV/TV(p＜0.01)。
　　 2.X線檢查證實(shí)在所有動(dòng)物骨折端對(duì)位對(duì)線良好。雙能X線骨密度掃描顯示，hPTH(1-34)和G1，R19(1-34)處理

16、組具有較高的骨密度(BMD)。2周時(shí)，hPTH(1-34)(BMD:45.92±1.62 mg/cm2, BMC10.33±0.61mg)和G1,R19(1-34)(BMD49.12±2.11 mg/cm2/BMC13.51±1.05mg)處理組的骨密度(BMD)和骨量(BMC)明顯高于對(duì)照組(BMD33.77±2.17 mg/cm2，BMC8.48±0.17 mg)。而G1，R19(1-34)較hPTH(1-34)高(p＜0.05)。

17、顯微CT掃描三維重建圖像顯示hPTH(1-34)和G1，R19(1-34)處理組較對(duì)照組產(chǎn)生更多的新骨(p＜0.05)。4周時(shí)，hPTH(1-34)和G1，R19(1-34)基本完成骨折愈合后改建，具有更高的BV/TV。生物力學(xué)顯示，hPTH(1-34)和G1，R19(1-34)處理組的剛度及最大力明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)。組織學(xué)分析顯示2周時(shí)hPTH(1-34)和G1，R19(1-34)處理組初級(jí)骨小梁較多，4周時(shí)，hPTH(1