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1、目前,糖尿病已成為威脅全人類(lèi)健康的重要疾病之一。研究證明,移植胰島是治愈糖尿病重癥患者的有效方法,但該醫(yī)學(xué)方法的發(fā)展卻受到了器官來(lái)源不足的制約,而異種移植是解決臨床器官移植供體來(lái)源短缺的有效途徑。在異種器官移植中面臨著超急性排斥反應(yīng),α-1.3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因GGTA1敲除的成功基本上解決了這個(gè)問(wèn)題,然而T細(xì)胞的排斥反應(yīng)仍然是制約異種器官移植發(fā)展的一大瓶頸。LEA29Y是一種能夠高效抑制T細(xì)胞活性的新型融合蛋白,該蛋白的廣泛性表達(dá)容易
2、導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物免疫力低下而不易存活,因此,制備胰島特異性表達(dá)LEA29Y的GGTA1基因敲除(GTKO)豬對(duì)于解決異種胰島移植的排斥反應(yīng)具有重大意義。
本研究利用豬胰島素啟動(dòng)子(porcine insulin promoter,PIP)和牛生長(zhǎng)激素poly A(bGHpA),構(gòu)建胰島β細(xì)胞特異性表達(dá)LEA29Y載體,同時(shí)利用TALENs誘導(dǎo)的NHEJ對(duì)GGTA1基因進(jìn)行敲除,得到了如下結(jié)果:
1、利用PIP(包括豬胰
3、島素基因第1外顯子和第1內(nèi)含子)和bGHpA構(gòu)建表達(dá)框,考慮到酶切位點(diǎn)插入不同位置可能對(duì)啟動(dòng)子效率造成影響,構(gòu)建了3種表達(dá)載體。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析比較,發(fā)現(xiàn)將PIP的內(nèi)含子拼接位點(diǎn)突變?yōu)镠indⅢ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)后,第1內(nèi)含子不剪切,但是可以介導(dǎo)下游基因穩(wěn)定高效地表達(dá),可以作為后續(xù)試驗(yàn)中胰島特異表達(dá)目的基因的理想表達(dá)框。
2、用1.2kb的LEA29Y基因取代胰島β細(xì)胞特異表達(dá)框中EGFP基因序列,體外轉(zhuǎn)染MIN-6小鼠胰島細(xì)胞和豬耳
4、成纖維細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LEA29Y只特異地在β細(xì)胞中表達(dá),與預(yù)期結(jié)果一致,表明該載體可以用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選,為制備胰島特異表達(dá)LEA29Y轉(zhuǎn)基因豬奠定了基礎(chǔ)。
3、根據(jù)五指山小型豬基因組序列設(shè)計(jì)敲除GGTA1基因的TALEN質(zhì)粒,與胰島特異性表達(dá)LEA29Y基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)五指山小型豬耳成纖維細(xì)胞,篩選獲得理想的GTKO/LEA29Y單細(xì)胞克隆,通過(guò)體細(xì)胞核移植獲得GTKO/LEA2
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