HSPA12A mRNA、Eml5和HSPBAP1在耐藥性癲癇患者腦組織中的表達.pdf

1、目的：研究耐藥性癲癇患者腦組織中差異基因及其蛋白產物的表達，并探討其在耐藥性癲癇發(fā)病機制中的作用。 材料和方法：從我科建立的耐藥性癲癇患者術后腦組織庫中隨機抽取顳葉26例，海馬10例作為本次研究的實驗組。其中男性19例，女性17例；年齡8-47歲，平均年齡21．88+9．62((x)±S)歲；病程2．5~30年，平均10．24+6．83((x)iS)年。部分繼發(fā)全身強直．陣攣性發(fā)作l7例，復雜部分性發(fā)作9例，多種發(fā)作形式10例(

2、強直性發(fā)作，單純部分性發(fā)作)。對照組8例，全部系來自顱腦外傷清創(chuàng)患者或意外死亡尸檢者的相對正常腦組織，納入的受試者無癲癇病史及其它中樞神經系統(tǒng)疾病的病史，且病理切片證實腦組織結構正常。其中顳葉5例，海馬3例；男4例，女4例，年齡17-66歲，平均31．59±11．65((x)±S)歲。 實驗組和對照組腦組織取出后部分立即放入液氮(一196℃)中冷凍保存，用于基因芯片掃描、熒光定量PCR(nuorescencequantitati

3、vepolymerasechainreaction，FQ-PCR)和Westernblot分析；部分置于4％多聚甲醛固定48h，隨后常規(guī)石蠟包埋切片，常溫保存用于免疫組化染色。先用含有4096個人類靶基因的基因芯片對差異表達的基因進行檢測，篩選出候選基因棘皮動物微管結合蛋白類似蛋白5mRNA(echinodermmicrotubuleassociatedproteinlike5mRNA，Eml5mRNA．GenBank：NM183387

4、)，熱休克蛋白27相關蛋白1mRNA(heatshook27kDaassociatedprotein1mRNA，HSPBAPlmRNA．(_ienl3ank：AK096705)和熱休克蛋白70相關蛋白12AmRNA(heatshock70kDaprotein12AmRNA，HSPAl2AmRNA．GenBank：XM_048898)后，用FQ-PCR，免疫組化和Westernblot對芯片掃描結果進行驗證。 結果： 1總

5、RNA抽提及質檢結果：兩組總RNA分別為279pg、275llg，總RNA的A260／A280比值分別為1．821、1．904，都位于1．8-2．2之間；電泳圖譜有清晰的條帶,70~C水浴保溫1h后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜未見明顯改變，提示兩樣品總RNA質檢合格。 2基因芯片：對含有4096個人類靶基因的基因芯片進行掃描，共檢測出142條相關基因存在差異表達，其中104條表達上調，38條表達下調。其中候選基因Eml5mRNA

6、,HSPBAPlmRNA和HSPAl2AmRNA的Cy5／Cy3比值分別為3．741、4．845和2．44l。 3FQ-PCR：樣品的三個孔道實時熒光曲線值基本擬合，CT(thresholdcycle)值接近，檢測結果顯示Eml5mRNA，HSPBAPlmRNA和HSPAl2AmRNA在耐藥性癲癇腦組織中的表達量均高于正常對照組。 4免疫組化：發(fā)現Eml5和HSPBAPl蛋白在耐藥性癲癇顳葉和海馬中高表達，與對照組相同部

7、位的光密度(opticaldensity，OD)值比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。 5Westernblot：耐藥性癲癇顳葉和海馬中Eml5和HSPBAPl的蛋白表達量均高于相同部位的對照組。 結論： 1基因芯片在篩選耐藥性癲癇相關差異基因表達時，具有快速、高通量、高靈敏度等特點。通過基因芯片技術對耐藥性癲癇患者術后腦組織差異表達基因的測定，可為耐藥性癲癇的發(fā)病機制從基因水平上提供依據。 2基因

8、水平和蛋白水均證實Eml5和HSPBAPl在耐藥性癲癇患者腦組織中的表達量高于對照組。HSPAl2AmRNA在耐藥性癲癇腦組織中的表達量高于對照組，FQ-PCR與基因芯片結果一致。 3耐藥性癲癇的主要病理改變是海馬苔蘚纖維發(fā)芽，Eml5蛋白表達上調可能促進神經元樹突和軸突延伸，觸發(fā)海馬苔蘚纖維發(fā)芽，最終導致病理性神經網絡重組和興奮性突觸重構。 4耐藥性癲癇患者腦組織中HSPBAPl的高表達可能抑制了熱休克蛋白27(hea

9、tshockprotein27，HSP27)的神經元保護功能，促進細胞色素C-caspase家族介導的細胞凋亡過程；激活Fas介導的依賴Daxxf一種Fas死亡結構域相關蛋白)的JNK／SAPK信號傳導通路，誘導神經元凋亡。HSPBAPl阻礙了磷酸化HSP27對肌動蛋白聚合作用的抑制，間接加強了微絲組裝，觸發(fā)海馬苔蘚纖維發(fā)芽。 5HSPAl2AmRNA表達上調可能在耐藥性癲癇發(fā)病機制中起重要作用，我們認為HSPAl2A可能作為重