碭山酥梨自然保護(hù)區(qū)梨S基因研究.pdf

1、安徽碭山酥梨自然保護(hù)區(qū)梨種質(zhì)資源豐富，碭山縣號(hào)稱“中國(guó)梨都”。碭山酥梨在世界水果市場(chǎng)占據(jù)重要地位。由于梨種內(nèi)變化大，加上種間的雜交，使碭山酥梨自然保護(hù)區(qū)梨在長(zhǎng)期的進(jìn)化和栽培中形成了豐富的資源類型。本試驗(yàn)對(duì)碭山酥梨自然保護(hù)區(qū)梨S基因進(jìn)行研究，對(duì)探討梨自交不親和的分子機(jī)理、有效利用這些資源、加快梨育種進(jìn)程有重要意義。 特異引物PCR方法是一種高效、穩(wěn)定、可靠的基因克隆手段。本試驗(yàn)按照S基因兩端保守序列，合成PCR克隆特異引物P1、P

2、2。通過(guò)對(duì)影響特異引物PCR體系的各主要因素的研究，建立了碭山酥梨自然保護(hù)區(qū)梨S基因分析的反應(yīng)體系：在50μL反應(yīng)總體積中，10xBuffer 5μL，Mgcl<,2> 0.10μm，dNTPs 0.02μm，P1 0.02μm，P2 0.02μm，ExTaqDNA 1.0U，模板DNA30 ng，加超純水至5μl。最佳的反應(yīng)參數(shù)是：94℃預(yù)變性3 min之后，94℃變性15sec、退火52℃30 sec、延伸72℃2 min、30個(gè)循

3、環(huán)，72℃延伸7 min。 利用確立的特異引物PCR技術(shù)體系對(duì)碭山酥梨自然保護(hù)區(qū)的27個(gè)梨品種的S基因進(jìn)行克隆與分離。在新高、雪花梨、豐水、南果梨、雞爪黃、鵝黃、杜梨、香面梨、伏酥、紅巴梨、銹酥、細(xì)皮酥、良梨早酥、馬蹄黃等14個(gè)品種中，各克隆出一條S基因條帶；而在庫(kù)爾勒香梨、萊陽(yáng)慈梨和紫酥梨等3個(gè)品種則各克隆出了兩條S基因條帶?？寺〕龅腟基因條帶長(zhǎng)度均在300bp～500bp。另外，紅香酥、黃冠、早美酥、扁酥、八怪梨、油皮酥、王

4、酥、碭山酥梨、桂酥、鴨梨等10個(gè)梨品種沒(méi)有克隆出S基因條帶。 試驗(yàn)以一次克隆產(chǎn)物為模板進(jìn)行二次克隆并回收、純化、克隆、測(cè)序。應(yīng)用BLAST在線軟件(www．ncbi．nlm．gov/blast/)進(jìn)行堿基序列比對(duì)分析，確定20條S基因的堿基序列中有14個(gè)不同的S基因類型，應(yīng)用Clustalw軟件進(jìn)行在線聚類(www．ebi．a(chǎn)c．uk．/ClustalW)，分析不同的S基因類型差異，鑒定出14個(gè)品種的一個(gè)S等位基因和3個(gè)品種的S