Gelsolin降低小鼠肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移力Hca-F細胞株的侵襲和運動能力.pdf

1、大連醫(yī)科大學博士學位論文Gelsolin降低小鼠肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移力HcaF細胞株的侵襲和運動能力姓名：王紹清申請學位級別：博士專業(yè)：病理學與病理生理學指導(dǎo)教師：唐建武20090601在淋巴道轉(zhuǎn)移潛能不同小鼠肝癌細胞系中的表達。2。構(gòu)建pSilencer—gelsolinshRNA表達載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca—F細胞并獲得gelsolin的表達水平穩(wěn)定下調(diào)的HcaF細胞株，同時建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer。無關(guān)序列HcaF細胞株作為對照。3

2、研究gelsolin在細胞內(nèi)的表達和下調(diào)其在HcaF細胞株的表達對小鼠肝癌細胞株HcaF在細胞增殖、細胞遷移和侵襲能力方面的影響，由此確定gelsolin與小鼠肝癌細胞淋巴道轉(zhuǎn)移潛能間的關(guān)系。方法：1采用細胞免疫組化、蛋白免疫印跡方法檢測gelsolin蛋白在HcaF、HcaP細胞株中表達有無差異，為進一步研究肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機制奠定基礎(chǔ)。2依據(jù)GeneBank中小鼠gelsolin基因序列(序列登錄號：NM一227753)合成三條sh

3、RNA的DNA模板的兩條單鏈，分別命名為gelsolinl、gelsolin2、gelsolin3和gelsolin無關(guān)序列，將pSilencerTM31H1neo質(zhì)粒雙酶切后分別與三條shRNA的DNA模板和無關(guān)序列的退火后產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物分別命名為pSilencershRNAgelsolin1、pSilencershRNA—gelsolin一2、pSilencer—shRNAgelsolin3、pSilencer—shRNAwg。

4、對三條pSilencershRNA表達載體經(jīng)測序鑒定準確后(引物為5。GTTTTCCCAGTCACGAC3’)，將三條pSilencershRNA表達載體和無關(guān)序列對照組分別以脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HcaF細胞，用含40099／mlG418的完全培養(yǎng)基篩選，獲得pSilencer—shRNAgelsolin表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HcaF細胞和無關(guān)序列對照組細胞。提取未處理的HcaF細胞株、穩(wěn)轉(zhuǎn)pSilencer無關(guān)序列的HcaF細胞株、穩(wěn)pSil

5、encergelsolinshRNA三條表達載體的HcaF細胞株的RNA、蛋白，RTPCR和WesternBlotting檢測shRNA轉(zhuǎn)染后HcaF細胞gelsolin在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。選出下調(diào)效果最好的一組細胞株用于后續(xù)實驗。3以三組細胞(分別為未處理的HcaF細胞株、穩(wěn)染了pSilencer無關(guān)序列的HcaF細胞株、穩(wěn)轉(zhuǎn)pSilencershRNAgelsolin1表達載體的HcaF細胞株)為實驗對象。以CCK8法檢測

6、三組細胞的細胞活力和分裂增殖能力；Transwell實驗檢測三組細胞的體外遷移能力(Transwell小室不做處理)、和侵襲能力(在Transwell上室中加人工基底膜)；分別在615小鼠足墊內(nèi)側(cè)接種三組細胞，2l06個／005ml細胞，28天后觀察各組淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果：1Gelsolin在小鼠腹水型肝癌細胞系HcaF細胞和HcaP細胞胞漿中表達，Western—blot分析顯示gelsolin在HcaF細胞中高表達，在HcaP