基于中醫(yī)整體觀念治法治則下的端錨酶和端粒酶反義寡核苷酸聯(lián)合作用對(duì)肺癌細(xì)胞端粒的影響及機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤，這種由于多種環(huán)境因素長期共同作用所產(chǎn)生的多基因疾病，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)注重對(duì)單基因、單靶點(diǎn)的對(duì)抗性治療下難以取得良好的效果。然而中醫(yī)講究整體、注重變化、注重平衡、辨證施治等基礎(chǔ)理論的挖掘，不但可以解決諸如惡性腫瘤等復(fù)雜多基因疾病的問題，而且可以促進(jìn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)向更高境界發(fā)展。 中醫(yī)整體觀念的治法治則為解決腫瘤分子生物學(xué)端粒抗癌靶點(diǎn)的難題提供了良好的思路。 端粒是真核生物細(xì)胞染色體末端的特殊核酸蛋白結(jié)構(gòu)，能保護(hù)染色體末端，以

2、維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。端粒長度的復(fù)制性縮短是通過端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄合成來修復(fù)的，而端粒長度的維持對(duì)于腫瘤細(xì)胞保持無限增殖的永生化傾向至關(guān)重要。因此，通過抑制端粒酶來控制腫瘤是近年來國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一．然而，理論推理的邏輯性和實(shí)驗(yàn)室工作的初步結(jié)果并沒有給臨床帶來滿意的效果。因?yàn)閺恼w的角度，除了端粒酶之外，還有眾多的端粒相關(guān)蛋白因子參與端粒的調(diào)控；從平衡的角度，單獨(dú)的端粒酶抑制是一種不完全的抑制。 從理論上看，端粒結(jié)合蛋白1(T

3、RF1)通過抑制端粒酶與端粒相互作用而對(duì)端粒長度起負(fù)向調(diào)節(jié)作用；而端錨酶能使TRF1發(fā)生ADP核糖基化而抑制其與端粒重復(fù)片段結(jié)合，是端粒長度的正向調(diào)節(jié)因子。端錨酶、端粒酶同時(shí)與TRF1相聯(lián)系，兩者的聯(lián)合則有可能成為腫瘤基因治療的一個(gè)靶點(diǎn)。 為此，首先構(gòu)建端錨酶反義寡核苷酸和反義端粒酶催化亞單位寡核苷酸，以其相應(yīng)的正義寡核苷酸為對(duì)照，采用脂質(zhì)體法將其導(dǎo)入端粒酶陽性的人肺腺癌細(xì)胞A549，觀察反義寡核苷酸對(duì)A549細(xì)胞端粒動(dòng)力學(xué)的影

4、響、與Bcl-2凋亡基因家族的相互聯(lián)系及反義寡核苷酸作用下A549細(xì)胞形態(tài)、功能的改變，探討端錨酶、端粒酶聯(lián)合作為腫瘤基因治療的可能性和機(jī)理，為日后腫瘤基因治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和充足的理論準(zhǔn)備。 目的 1.觀察端錨酶，端粒酶兩種反義寡核苷酸聯(lián)合作用對(duì)端粒酶催化亞單位(hTERT)mRNA轉(zhuǎn)錄、端粒酶及端錨酶蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響；探討兩種反義寡核苷酸作用對(duì)細(xì)胞端粒長度的影響。 2.探討兩種反義寡核苷酸與Bcl-

5、2凋亡基因家族相互作用的聯(lián)系，收集其基因?qū)W證據(jù)。 3.觀察兩種反義寡核苷酸持續(xù)作用下A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，細(xì)胞傳代與端粒縮短之聞的相互關(guān)系，細(xì)胞氚攝取率及X-Gal轉(zhuǎn)染率等功能學(xué)改變，探討其腫瘤基因治療的潛在價(jià)值． 方法與結(jié)果： 1.運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)A549細(xì)胞端粒酶催化亞單位(hTERT)mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：端粒酶催化亞單位反義寡核苷酸(ashTERT)下調(diào)hTERT

6、mRNA的轉(zhuǎn)錄；而端錨酶正、反義寡核苷酸(sTANKS、asTANKS)不影響其轉(zhuǎn)錄；端粒酶催化亞單位及端錨酶反義寡核苷酸聯(lián)合(ashTERT+asTANKS)時(shí)hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄水平無額外的變化． 2.采用多聚合酶鏈一酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(PCR-ELISA)定量分析端粒酶活性。結(jié)果顯示：ashTERT明顯抑制端粒酶活性；asTANKS、sTANKS作用下端粒酶活性無明顯變化；asTANKS與ashTERT聯(lián)合作用下端粒酶

7、活性亦無明顯額外變化。 3.采用Western Blot法檢測(cè)端錨酶活性顯示：asTANKS明顯抑制端錨酶活性;ashTERT、shTERT作用下端錨酶活性無明顯變化；ashTERT與asTANKS聯(lián)合作用下端錨酶活性亦無明顯額外變化。 4.通過定量熒光原位雜交法(Q-FISH)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞端粒長度。結(jié)果顯示：與sTANKS、shTERT比較，asTANKS、ashTERT均可導(dǎo)致細(xì)胞端粒長度的明顯縮短；

8、而asTANKS+ashTERT的聯(lián)合作用使細(xì)胞端粒長度的縮短更為明顯，兩者有協(xié)同作用。 5.以RT-PCR法分析反義寡核苷酸作用下A549細(xì)胞mcl-1、Bcl-2和Bax基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)：ashTERT不影響上述三種基因的轉(zhuǎn)錄水平：asTANKS除上調(diào)mcl-1基因的轉(zhuǎn)錄外，對(duì)Bcl-2和Bax基因無影響；并且asTANKS的此種作用不因ashTERT的聯(lián)合而發(fā)生改變。 6.Western Blot法檢測(cè)Mel-1

9、、Bcl-2及Bax蛋白活性顯示：ashTERT對(duì)Mcl-1總蛋白活性無影響，但可使蛋白短拼接體的(Mcl-1s)含量下降；ashTERT對(duì)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)無影響。asTANKS上調(diào)Mcl-1蛋白的表達(dá)，并且上調(diào)Mcl-1s的比例；對(duì)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)無影響。asTANKS+ashTERT的聯(lián)合作用可逆轉(zhuǎn)Mcl-1s含量的下降，促進(jìn)Mcl-1s、Mcl-1總蛋白活性的上調(diào)。 7.普通光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡觀

10、察，經(jīng)asTANKS、ashTERT作用的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上漸出現(xiàn)細(xì)胞衰老的征象，并且在后期的傳代試驗(yàn)中細(xì)胞凋亡的比例漸增；而asTANKS+ashTERT聯(lián)合作用時(shí)細(xì)胞衰老和凋亡的特征更明顯。 8.細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：經(jīng)asTANKS、ashTERT處理后的細(xì)胞傳代時(shí)間明顯延遲，細(xì)胞增殖周期明顯縮短；而asTANKS+ashTERT聯(lián)合作用時(shí)細(xì)胞增殖周期的縮短更為明顯，兩者有協(xié)同作用。 9.經(jīng)asTANKS、ashTE

11、RT處理后的細(xì)胞氚攝取率隨細(xì)胞傳代的進(jìn)行逐漸下降，并且asTANKS+ashTERT聯(lián)合作用組細(xì)胞氚攝取率降低更為明顯，作為sTANKS、shTERT對(duì)照組的細(xì)胞氚攝取率無明顯改變． 10.經(jīng)asTANKS、ashTERT處理后的細(xì)胞細(xì)胞X-Ga1轉(zhuǎn)染率隨細(xì)胞傳代的進(jìn)行逐漸升高，并且asTANKS+ashTERT聯(lián)合作用組細(xì)胞X-Ga1轉(zhuǎn)染率升高更為明顯，作為sTANKS、shTERT對(duì)照組的細(xì)胞X-Ga1轉(zhuǎn)染率無明顯改變。

12、 結(jié)論 1.基于中醫(yī)學(xué)整體平衡觀念的治法治則對(duì)于解決惡性腫瘤端?？拱┌悬c(diǎn)的難題具有明顯的指導(dǎo)意義。 2.端錨酶反義寡核苷酸通路是完全有別于端粒酶的端粒抑制途徑，其縮短細(xì)胞端粒長度的作用發(fā)揮有賴于減少自身端錨酶的活性。 3.端錨酶和端粒酶反義寡核苷酸在加速細(xì)胞端粒長度的縮短、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞衰老、凋亡方面具有協(xié)同作用。 4.端錨酶和端粒酶反義寡核苷酸協(xié)同作用的機(jī)理可能與mcl-1基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的上調(diào)