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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
1.驗(yàn)證2型糖尿病(T2DM)易感基因CDKAL1 rs7756992位點(diǎn)和KCNQ1 rs2237892位點(diǎn)與中國漢族人群T2DM的關(guān)聯(lián)。
2.分析rs7756992(CDKAL)和rs2237892(KCNQ1)不同基因型與T2DM臨床特征和糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)聯(lián),為浙江省溫州地區(qū)易感人群的篩選和疾病分子分型提供基礎(chǔ)。
3.分析線粒體DNA單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)T16189C變異與中國漢
2、族人群T2DM的關(guān)聯(lián),為T2DM的研究提供新的依據(jù)。
方法:
1.研究對(duì)象:所有研究對(duì)象均來自于浙江省溫州地區(qū)漢族人群,其中病例組為溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科住院部2009年3月-2011年10月期間確診的2型糖尿病患者,而非糖尿病對(duì)照組人群為2009年12月-2011年10月期間于溫州市體檢中心參加體檢的體檢者。本研究經(jīng)過溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),調(diào)查和取樣均征得參與者本人同意并簽署了知情同
3、意書。
2.標(biāo)本DNA提取:使用專用的血液DNA提取試劑盒及磁珠提取法,對(duì)收集的樣本進(jìn)行全基因組DNA提取,并用NanoDrop2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度后,保存在-30℃冰箱備用。
3.基因分型:采用高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)區(qū)分樣本基因型。首先設(shè)計(jì)兩對(duì)HRM特異性引物,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和HRM基因分型,最后使用LightCycler(@)480 Gene scanning軟件自動(dòng)化分組功能進(jìn)
4、行結(jié)果分析。另外,隨機(jī)抽取病例-對(duì)照組標(biāo)本各20例進(jìn)行DNA直接測(cè)序,驗(yàn)證HRM技術(shù)的特異性和靈敏度。
4.PCR擴(kuò)增技術(shù)和DNA直接測(cè)序技術(shù):選取包含線粒體DNA16189C和一些多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行DNA直接測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用DNA Star等相關(guān)軟件與劍橋參考序列進(jìn)行分析。
5.數(shù)據(jù)分析:CDKAL1計(jì)量資料呈正態(tài)分布變量用X±S表示,非正態(tài)分布用中位數(shù)(四分位間距)
5、表示,而KCNQ1和T16189C的所有計(jì)量資料均用X±S表示。兩組臨床基本特征分析中,非正態(tài)分布變量經(jīng)對(duì)數(shù)變量變換后轉(zhuǎn)為正態(tài)后使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),而未轉(zhuǎn)為正態(tài)的變量用秩和檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料(性別)用x2檢驗(yàn)分析。 Hardy-Weinberg平衡試驗(yàn)檢驗(yàn)本研究所選樣本是否具有群體代表性。rs7756992位點(diǎn)和rs2237892位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和糖尿病慢性并發(fā)癥關(guān)聯(lián)分析用例數(shù)(%)表示,使用x2檢驗(yàn)和二項(xiàng)Logi
6、stic回歸分析,與T2DM患者臨床特征分析使用單因素方差分析(ANO VA)和多元線性回歸分析。16189C和一些多態(tài)性位點(diǎn)組成的單體型在病例-對(duì)照組中的分布用例數(shù)(%)表示,使用x2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果:
1.在浙江溫州地區(qū)漢族人群中,CDKAL1基因rs7756992位點(diǎn)基因型GG/AA(P=0.048)和等位基因A/G(P=
7、0.045)在T2DM組和對(duì)照組間差異顯著,證實(shí)G為該位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因。
2.對(duì)T2DM組內(nèi)不同基因型的臨床特征分析發(fā)現(xiàn),rs7756992位點(diǎn)GG基因型T2DM患者空腹血糖濃度偏低(年齡/性別校正后,P<0.001)而HbAl c值未見差異。
3.T2DM患者中,rs7756992位點(diǎn)等位基因和基因型頻率在各種糖尿病慢性并發(fā)癥間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
4.在浙江溫州地區(qū)漢族人群中,KCNQ1基
8、因rs2237892位點(diǎn)等位基因C/T(P<0.001)、基因型CC/TT(P<0.001)、基因型CC/(CT+TT)(P=0.006)和基因型(CC+TT)/TT(P<0.001)在T2DM組和對(duì)照組間有顯著差異。
5.對(duì)T2DM組內(nèi)不同基因型的臨床特征,使用二項(xiàng)Logistic回歸,經(jīng)過性別、年齡和體重指數(shù)校正后分析發(fā)現(xiàn),rs2237892位點(diǎn)CC基因型和CT+TT基因型相比,收縮壓(P=0.015)以及糖尿病合并高
9、血壓(P=0.04)和糖尿病大血管病變(P=0.05)在兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
6.線粒體DNAT16189C和一些多態(tài)性位點(diǎn)(249A-del,12705T,16223T,16298C,16519C)構(gòu)成的5組單體型在第一組病例-對(duì)照組人群中顯示與T2DM顯著相關(guān),其中249A-del呈負(fù)相關(guān),相反,另外4組則呈正相關(guān)。
7.第一組和第二組研究對(duì)象綜合后再次分析線粒體DNA中5組單體型(16189C和24
10、9A-del,12705T,16223T,16298C,16519C)與T2DM的關(guān)聯(lián),結(jié)果顯示除16189C/16298C單體型在T2DM組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,另外4組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
1.本研究在浙江溫州地區(qū)漢族人群中進(jìn)一步證實(shí)了CDKAL1基因rs7756992位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的關(guān)聯(lián);另外,該位點(diǎn)可能對(duì)T2DM血糖調(diào)節(jié)機(jī)制有一定影響,這還需要進(jìn)一步研究。
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