中國重慶非糖尿病性重度冠心病血清線粒體DNA T16189C巢式PCR-RFLP多態(tài)性分析.pdf

1、目的：
　　建立巢式.多聚酶鏈反應，限制性片段長度多態(tài)性分析(nested-polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism，nested-PCR-RFLP)方法檢測血清線粒體DNA T16189C(mitochondrial DNA T16189C，mtDNA T16189C)變異，分析T16189C多態(tài)性與重慶地區(qū)非糖尿病性(non-diabet

2、es mellitus，non-DM)重度冠心病(coronary heart disease，CHD)的相關性。
　　方法：
　　1.建立血清DNA的提取方法，設計針對mtDNA T16189C變異位點的外套引物和內(nèi)套引物，分別以內(nèi)套引物行常規(guī)PCR，以內(nèi)、外套引物行nested-PCR擴增目的基因，電泳確認血清mtDNA提取成功，并比較兩種方法對血清mtDNA檢測的敏感性。nested-PCR產(chǎn)物經(jīng)RFLP和測序鑒定確認

3、mtDNA T16189C變異位點，并對nested-PCR-RFLP進行方法學評價。
　　2.收集中國重慶地區(qū)82例非糖尿病性重度CHD患者血清及對應臨床資料，50例非糖尿病、非冠心病受試者血清作為對照。提取血清DNA，聯(lián)合應用常規(guī)PCR及nested-PCR評估不同組別血清mtDNA含量的高低。利用建立的nested-PCR-RFLP方法檢測mtDNA T16189C變異位點，分別比較mtDNA含量、mtDNA T16189C

4、變異與該類人群的相關性，并進一步分析非糖尿病性重度CHD不同mtDNA含量組間mtDNA T16189C變異情況。
　　結果：
　　1.血清mtDNA的提取和nested-PCR-RFLP方法的建立及評價：(1)成功建立了血清mtDNA提取和血清mtDNA的nested-PCR-RFLP方法，通過實驗優(yōu)化得到PCR和酶切反應的最佳條件，經(jīng)RFLP和測序鑒定與預期結果一致。(2)nested-PCR電泳檢測Qiagen試劑盒所

5、提200μ人類血清的mtDNA的敏感性為100％，nested-PCR-RFLP檢測血清mtDNA T16189C多態(tài)性簡單快速、特異性和敏感性均高。
　　2.血清mtDNA濃度及mtDNA T16189C變異與非糖尿病性重度CHD危險因素的相關性分析：(1)血清mtDNA含量在非糖尿病性重度CHD患病組顯著低于健康對照組(X2=9.979，P<0.05，OR=0.318，95％ CI：0.153～0.660)；在患病組中，女性高

6、于男性，并隨年齡增加而增加，高LDL-c組低于正常組、吸煙低于非吸煙組(P<0.05)；在血壓、HDL-c，TC、血糖調(diào)節(jié)各組內(nèi)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。多因素非條件logistic回歸分析結果顯示：吸煙(OR=3.70；95％ CI：1.285～10.870)是導致血清mtDNA濃度減低的主要影響因素。(2)mtDNA T16189C變異率在非糖尿病性重度CHD組(32.93％)高于健康對照組(22％)，但差異無統(tǒng)計學意義(P

7、>0.05)；在重度CHD病人中，合并血糖調(diào)節(jié)受損(impired glucose tolerance，IGT)者明顯高于血糖正常者和健康對照(P<0.05)，但血糖正常重度CHD組和健康對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在重度CHD病人中，合并高血壓者高于血壓正常重度CHD組和健康對照組(P<0.05)，但血壓正常重度CHD組和健康對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。重度CHD組內(nèi)及其與對照組之間，mtDNA T16189

8、C變異率與性別、年齡、吸煙、LDL-c、HDL-c、TC等因素均無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。非條件logistic回歸分析結果顯示：高血壓(OR=3.265；95％ CI：1.061～10.06)是導致血清mtDNA T16189C變異的主要影響因素。(3)非糖尿病性重度CHD患者血清mtDNA T16189C變異率在mtDNA高濃度組顯著高于低濃度組(X2=5.612，P<0.05；OR=3.154，95％ CI：0.19

9、7～8.307)。
　　結論：
　　成功建立了血清mtDNA T16189C的提取及nested-PCR-RFLP方法，可作為循環(huán)mtDNA基因多態(tài)性和相關性流行病學研究的重要工具之一。
　　非糖尿病性重度CHD患者血清mtDNA含量顯著低于健康對照，且女性組高于男性組、高齡組高于低齡組、高LDL組低于正常組、吸煙低于非吸煙組；并且吸煙足導致血清mtDNA濃度減低的主要影響因素。mtDNA T16189C變異率與血糖調(diào)