鈉-氫交換子1在醛固酮所致大鼠腎小球硬化中的作用及機制探討.pdf

1、第一部分 鈉氫交換子1在醛固酮所致大鼠腎小球硬化中的作用體內(nèi)研究
　　 目的:
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn),醛固酮與臟器纖維化等病變密切相關,并且可作為一個獨立的致病因素直接參與纖維化過程。鈉氫交換子1(NHE1)是一種糖蛋白,除了調節(jié)酸堿平衡、穩(wěn)定細胞內(nèi)pH的作用外,目前有研究發(fā)現(xiàn)NHE1還能對細胞周期進行調節(jié),NHE1也被證實參與了腎臟纖維化的發(fā)生,但是在腎臟纖維化過程中醛固酮的致纖維化作用是否與NHE1有關尚不清楚。為了

2、證實NHE1在醛固酮所致大鼠腎小球硬化中的作用,我們在本部分的研究中擬通過體內(nèi)實驗證明大鼠腎小球也是醛固酮作用的靶目標,并在體內(nèi)環(huán)境直接探討醛固酮是否參與慢性腎小球損傷的發(fā)展以及NHE1在其中的作用和相關機制。
　　 (一)MR和11β-HSD2在大鼠腎小球中的表達
　　 方法:
　　 用正常SD大鼠的腎臟分別制各石蠟和冰凍切片,并用篩網(wǎng)法提取腎小球蛋白,同時分別提取腎臟皮質和髓質蛋白。選擇醛固酮作用的特異性受體

3、MR和保證醛固酮和其受體特異性結合的酶11β-HSD2作為局部醛固酮系統(tǒng)存在的關鍵指標,分別用免疫組化、免疫熒光和Western blot檢測上述指標在腎臟的分布區(qū)域和表達量。
　　 結果:
　　 1.免疫組化結果顯示陽性11β-HSD2表達在腎皮質的遠曲小管和集合管,染色陽性細胞在上皮細胞的胞核和胞漿中都有大量分布,但是在腎小球和近曲小管也可見到少量表達,高倍鏡下可見在腎小球中的陽性部位主要位于腎小球系膜區(qū)和近曲小管的

4、胞漿;采用免疫熒光的方法,發(fā)現(xiàn)11β-HSD2主要表達在腎臟的遠曲小管和集合管上皮細胞,在腎小球也有少量表達:
　　 2.免疫組化結果顯示陽性MR表達在腎皮質的遠曲小管和集合管,染色陽性細胞在上皮細胞的胞核和胞漿中都有大量表達,但是在腎皮質的腎小球和近曲小管也可見到少量表達;采用免疫熒光的方法,用綠色熒光FITC標記,發(fā)現(xiàn)MR主要表達在腎臟的遠曲小管和集合管上皮細胞,在腎小球的系膜區(qū)也有少量表達;
　　 3.采用免疫熒光

5、的方法,用綠色熒光FITC標記,發(fā)現(xiàn)11β-HSD2和MR主要表達在腎臟的遠曲小管和集合管上皮細胞,在腎小球的系膜區(qū)也有少量表達:
　　 4.Western blot檢測發(fā)現(xiàn),MR在髓質中表達量最高,在皮質中由于有大量腎小管的存在,也有所表達,我們發(fā)現(xiàn)新鮮腎臟獲得的腎小球蛋白中能檢測到MR的少量表達。
　　 結論:
　　 在本部分的研究中,我們在體內(nèi)證實大鼠腎小球內(nèi)存在MR和11β-HSD2的陽性表達,大鼠腎小球

6、也是醛固酮體內(nèi)作用的靶目標。
　　 (二)鈉氫交換子1在醛固酮所致大鼠腎小球硬化中的作用體內(nèi)研究
　　 方法:
　　 用體重180-200g雄性SD大鼠建立5/6腎大部切除模型,實驗分組如下:(1)假手術組(SHAM組):(2)5/6腎切組(SNX組);(3)SNX+醛固酮組(ALDO組);(4)ALDO+NHEl抑制劑DMA組(DMA組),成模后12周處死大鼠,進行常規(guī)血、尿生化檢測及尾動脈收縮壓測定,PAS和

7、Masson染色觀察大鼠腎小球硬化和腎小管間質纖維化程度;免疫組化和Western blot檢測各組大鼠腎組織的FN、TGF-β1和PCNA的表達情況。
　　 結果:
　　 1.成模后12周,5/6腎大部切除大鼠均出現(xiàn)明顯的高血壓,蛋白尿和腎功能嚴重損害。和SNX組相比,ALDO組的血壓(mmHg)升高更顯著(ALDO:224±9.4 vs.SNX:194±6.36,p＜0.01),蛋白尿(mg/24h)(ALDO:23

8、7.93±10.06 vs.SNX:82.76±4.65,p＜0.01)和腎功能損害(血清肌酐值:μmol/L)(ALDO:123.57±11.12 vs.SNX:85.5±4.96)更嚴重,DMA組大鼠比ALDO組大鼠蛋白尿有明顯減輕(DMA:163.73±10.15 vs.ALDO:237.93±10.06,p＜0.01),但是對高血壓和腎功能損害并沒有明顯的改善作用;
　　 2.PAS染色顯示,除SHAM組外的四個實驗組大

9、鼠腎小球均呈局灶節(jié)段性硬化甚至全小球硬化,其中以ALDO組最為顯著;與ALDO相比,DMA組的腎小球增殖和硬化程度明顯減輕(DMA:3.1±0.176 vs.ALDO:3.35±0.15,p＜0.01)。Masson染色顯示與SHAM組相比,手術實驗組均有明顯的的腎小管間質纖維化,伴小管擴張和蛋白管型。ALDO組和SNX組相比,大鼠的間質纖維化程度明顯加重(ALDO:2.225±0.1 17 vs.SNX:1.9±0.085,p＜0.0

10、5),DMA對ALDO所致間質纖維化和蛋白管型沒有明顯改善作用:
　　 3.免疫組化指數(shù)評分結果表明,FN在腎大部切除大鼠腎小球和小管間質內(nèi)均有大量表達,表達水平均顯著高于SHAM組。ALDO組和DMA組FN表達明顯高于SNX組(ALDO:0.733±0.04,DMA:0.725±0.062 vs.SNX:0.617±0.047,p＜0.01),但是這兩組之間沒有明顯差異:
　　 4.免疫組化和Western blot結

11、果均提示各組大鼠腎組織TGF-β1表達水平顯著高于SHAM組,免疫組化指數(shù)的評分結果表明,ALDO組TGF-β1表達水平高于SNX組,但是無明顯統(tǒng)計學差異(ALDO:0.73±0.024 vs.SNX:0.69±0.03,p＞0.05),和ALDO組相比,DMA組的TGF-β1表達有所下降(DMA:0.64±0.047 vs.ALDO:0.73±0.024,p＜0.01)。Western blot結果提示ALDO組TGFβ1蛋白水平比S

12、NX組進一步升高(ALDO:431.33±19.04 vs.SNX:207.83±9.61.p＜0.01)。和ALDO組相比,DMA組的TGF-β1表達有所下降(DMA:0.64±0.047 vs.ALDO:0.73±0.024,p＜0.05);
　　 5.免疫組化和Western blot結果均提示,腎大部切除后PCNA表達明顯高于SHAM組,其中ALDO組表達最高,DMA組的PCNA表達和ALDO組相比有所下降。
　　

13、 結論:
　　 我們的體內(nèi)研究結果提示,NHE1介導了醛固酮所致大鼠腎小球硬化的作用,而且不依賴于血流動力學作用。其抑制劑DMA能顯著改善5/6腎大切動物模型的腎小球硬化,其機理可能是通過抑制細胞外基質的積聚以及腎小球系膜細胞的增殖。
　　 第二部分 醛固酮通過鈉氫交換子l誘導腎小球系膜細胞外基質增生的作用探討
　　 目的:
　　 我們在前面第一部分的體內(nèi)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),NHE1介導了醛固酮所致大鼠腎小

14、球硬化的作用,而且不依賴于血流動力學作用。其抑制劑DMA能顯著改善5/6腎大切動物模型的腎小球硬化,且其機理可能是通過抑制系膜細胞外基質的積聚以及系膜細胞的增殖。由于體內(nèi)環(huán)境比較復雜,為了排除眾多體內(nèi)因素的干擾,我們在本部分的研究中,選擇與腎小球硬化細胞外基質分泌密切有關的重要固有細胞——系膜細胞,旨在探討在腎小球系膜細胞(mesangial cell,MC)上醛固酮是否能夠激活NHEl,以及是否能通過NHEI誘導腎小球系膜細胞外基質增

15、生。從而進一步在體外實驗中證實NHE1介導了醛固酮所致大鼠腎小球硬化的作用。
　　 方法:
　　 體外培養(yǎng)大鼠系膜細胞(MC),并進行如下分組:對照組(普通培養(yǎng)液),醛固酮組(10-7 mol/L)(Aldo),醛固酮+安體舒通(10-9 mol/L)組(Aldo+Spir),醛固酮+NHE1抑制劑Dimethylamiloride(DMA,251μmol/L)組(Aldo+DMA)。24小時后收集培養(yǎng)上清液和各組細胞,

16、抽提總RNA。用酸負荷后鈉依賴的pHi(細胞內(nèi)pH值)的變化來檢測NHEl活性,同時采用Real-time PCR檢測NHEl基因表達,采用流式細胞術和Western blot檢測NHE1蛋白表達;采用ELISA方法檢測細胞外基質成分纖連蛋白FN的蛋白表達。
　　 結果:
　　 1.與對照組相比,醛固酮組腎小球系膜細胞NHE1的活性(△pHi/100s)與對照組相比顯著增高(Cont 4.48±0.25％ vs.Aldo

17、 5.29±0.11％,p＜0.05),加入安體舒通和DMA后活性均有所降低(Aldo+Spir 4.92±0.35％,Aldo+DMA 4.07±0.23％,vs.Aldo 5.29±0.11％,p＜0.05);
　　 2.Real-time PCR結果顯示Aldo組NHE1 mRNA水平有所增高,是對照組的1.16倍(p＜0.05),而Aldo+Spir組NHE1的mRNA水平明顯下降,是Aldo組的81.9％(p＜0.05

18、),安體舒通本身對NHEl的基因表達沒有影響;
　　 3.Western blot結果顯示Aldo組NHE1蛋白水平顯著增高(Cont 401.74±17.96:vs.Aldo 535.84±8.67,p＜0.01),而Aldo+Spir組NHE1蛋白水平明顯下降(Aldo535.84±8.67 vs.Aldo+Spir 457.64±11.27,p＜0.05),安體舒通本身對NHE1的蛋白表達沒有影響。流式細胞術檢測結果與We

19、stern blot相似;
　　 4.ELISA方法檢測纖連蛋白(Fibronectin,FN)的水平,結果顯示Aldo組FN水平有所增高(Cont 17.84±3.77 vs.Aldo 51.66±1.40,P＜0.01);和Aldo組相比,Aldo+Spir組和Aldo+DMA組FN水平(ng/ml)有所下降(Aldo+Spir 29.60±1.99,Aldo+DMA25.75±4.66,vs.Aldo 51.66±1.40

20、,p＜0.01)。
　　 結論:
　　 醛固酮能夠刺激腎小球系膜細胞分泌細胞外基質,其作用可能是由于醛固酮激活系膜細胞NHE1活性、上調其基因和蛋白表達所致。
　　 第三部分 ERK1/2通路介導鈉氫交換子l在醛固酮誘導大鼠腎小球系膜細胞外基質增生中的作用
　　 目的:
　　 在第二部分的研究中,我們的結果提示醛固酮能夠刺激腎小球系膜細胞分泌細胞外基質,其作用可能是由于醛固酮激活系膜細胞NHEl活

21、性、上調其基因和蛋白表達所致。而ERK1/2通路在腎小球系膜細胞的細胞外基質積聚的過程中又發(fā)揮了極為重要的作用。因此本部分研究擬通過構建NHE1的短發(fā)夾狀RNA抑制NHE1表達,從而探討ERK1/2通路是否介導了醛固酮通過NHE1致大鼠系膜細胞外基質增生的作用。
　　 方法:
　　 構建靶向NHE1的短發(fā)夾狀雙鏈RNA的真核表達質粒(shRNA-NHE1)并將該質粒轉染體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞,分別于轉染后1天、3天

22、、4天采用熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot法從mRNA和蛋白水平觀察對NHE1的抑制作用。轉染4天成功抑制NHE1的表達后,實驗分組如下:(1)對照組:只加入培養(yǎng)液;(2)醛固酮組:培養(yǎng)液中加入醛固酮10-7 mol/L;(3)醛固酮+shRNA-NHE1組:shRNA-NHE1質粒DNA轉染96小時后加入醛固酮10-7 mol/L:(4)醛固酮+安體舒通組:用安體舒通10-9 mol/L先孵育3小

23、時后加用醛固酮10-7 mol/L;(5)醛固酮+PD98059(ERK1/2拮抗劑)組:同時加入醛固酮10-7 mol/L和25 μM PD98059。干預24h后,分別提取各組細胞蛋白以及上清液,用于NHE1,ERK1/2和phosphor-ERK1/2的Western blot檢測以及ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中細胞外基質成分纖連蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1.Real-time PCR結果顯示轉染后24小

24、時shRNA-NHE1組NHE1的mRNA表達即開始下降36.90％,轉染3天、4天后NHE1的基因表達可進一步降低,分別下降69.2％和77.9％;
　　 2.Western blot顯示轉染后24小時NHE1的蛋白表達無明顯變化(Control 426.56±12.17,Negative 434.94±23.91 vs.Iday 368.47±13.7,p＞0.05);3天后蛋白水平顯著下降(negative 434.9±2

25、3.91 vs.3day 260.59±12.04,p＜0.01),4天后抑制作用更明顯(negative 434.9±23.91 vs.4day 107.585±7.66,p＜0.01);
　　 3.ELISA方法顯示在無該質粒轉染的系膜細胞中,醛固酮刺激后可導致上清液中FN水平明顯升高,而當細胞轉染shRNA-NHE1質粒,醛固酮的上述作用被明顯抑制(Control 17.74±1.38ng/ml,Aldo+shRNA-Ne

26、gative 51.78±1.15ng/ml vs.Aldo+shRNA-NHE1 28.07±1.73ng/ml,p＜0.01):安體舒通或PD98059干預24h后也可拮抗醛固酮刺激所刺激的FN增生的作用(Aldo+Spir 29.60±.99ng/ml,Aldo+PD98059 29.82±1.39 ng/ml,vs.Aldo+shRNA-Negative 51.78±1.15ng/ml,p＜0.01);
　　 4.Wes

27、tern blot結果發(fā)現(xiàn)醛固酮刺激24h后系膜細胞NHEl的表達增強(Control 139.31±9.95 vs.Aldo 351.4±42.16,p＜0.01)可以被PD98059所抑制(Aldo 351.4±42.16,vs.Aldo+PD98059 225.68±21.13,p＜0.05);相反,醛固酮作用24h后,大鼠系膜細胞磷酸化ERK1/2的水平明顯增高(Control 280.52±33.46vs.Aldo 513.2

28、2±24.77,p＜0.01),且醛固酮對ERK1/2磷酸化的激活作用在轉染shRNA-NHE1成功抑制NHE1表達后依然存在(Aldo 513.22±24.77 vs.Aldo±shRNA-NHE1 462±24.34,p＞0.05)。
　　 結論:
　　 通過構建靶向NHE1的shRNA真核表達載體導入細胞可以特異性抑制大鼠腎小球系膜細胞NHE1的表達,同時顯著抑制醛固酮引起的細胞外基質增生,且該作用可能是通過ERK