核因子κB在腎小球硬化中的作用及反義核酸的干預(yù).pdf

1、目的：從分子水平探討腎小球硬化的發(fā)病機(jī)制，觀察。腎小球硬化大鼠蛋白尿等腎病表現(xiàn)及腎組織病理改變，從蛋白水平分析腎小球硬化相關(guān)因子的作用以及NF-кB與腎小球硬化、細(xì)胞凋亡的關(guān)系。應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)抑制腎組織NF-кB的基因翻譯表達(dá)，觀察對(duì)腎小球硬化的保護(hù)作用，為合理應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：將45只SD大鼠右側(cè)腎切除加尾靜脈注射阿霉素 (6mg/kg)制作腎小球硬化大鼠模型，隨機(jī)分成四大組：病理模型組(B

2、組，9只)，正義核酸組(C組，12只)，無(wú)義核酸組(D組，12只)，反義核酸組(E組，12只)。其中C、D、E組三組又各自分成兩小組，分別為：C1組，正義核酸組6只；C2組，正義核酸+脂質(zhì)體組6只。D1組，無(wú)義核酸組6只；D2組，無(wú)義核酸+脂質(zhì)體組6只。E1組，反義核酸組6只；E2組，反義核酸+脂質(zhì)體組6只。另9只為假手術(shù)組(A組)，假手術(shù)1周后，給予尾靜脈注射0.4ml生理鹽水。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水及飲食，共8周。8周后C1、D1、

3、E1、C2、D2、E2組分別給予不同的藥物干預(yù)，A、B組分別給予等量的5％GS。 分別在三個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)：A時(shí)間點(diǎn)(建模8周)、B時(shí)間點(diǎn)(給藥3天后)、C時(shí)間點(diǎn)(給藥7天后)留取血、尿標(biāo)本測(cè)定血白蛋白(ALB)、膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)，測(cè)定24h尿蛋白排泄量。腎臟標(biāo)本部分放置于10％福爾馬林液，部分分離腎皮質(zhì)，一70℃保存。 用Western-blot檢測(cè)腎皮質(zhì)TGF-β1、磷酸化NF-кBp

4、65的蛋白表達(dá)；免疫組化檢測(cè)腎組織活化NF-кBp65、Caspase-3的表達(dá)及分布；TUNEL 檢測(cè)腎小球細(xì)胞凋亡；ELISA方法測(cè)定血清IL-6、TNF-α水平。HE染色觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化，利用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算腎小球硬化指數(shù)(GI)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多樣本均數(shù)間的多重比較采用LSB-t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用非參數(shù)檢

5、驗(yàn)。變量間關(guān)系采用直線相關(guān)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1．生化改變 在A時(shí)間點(diǎn)，B組出現(xiàn)明顯蛋白尿，血白蛋白下降及CHOL、BUN升高，與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 在B時(shí)間點(diǎn)，與B組比較，E2組的尿蛋白、CHOL、BUN降低56％、42％、71％。E1組尿蛋白、CHOL 與B組比較降低40％，57％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。 在C時(shí)間點(diǎn)，與B組比較，

6、E2組的尿蛋白、CHOL、BUN降低65％、38％、46％，血白蛋白升高23％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E1組除CHOL有所升高外，其余指標(biāo)與B組比較無(wú)差異(P>0.05)。 2．病理結(jié)果 A組腎小球及腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)基本正常。B組部分腎小球出現(xiàn)節(jié)段性硬化，多數(shù)呈現(xiàn)節(jié)段性系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生、玻璃樣變性、泡沫細(xì)胞的增多或伴有球囊粘連、囊腔擴(kuò)大，部分腎小球呈現(xiàn)代償性肥大。腎小管上皮細(xì)胞變性，多灶性萎縮，部分代償性肥

7、大，蛋白管型，腎間質(zhì)纖維化，彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。隨著時(shí)間的推移，硬化的腎小球數(shù)目逐漸增多，硬化面積逐漸擴(kuò)大，出現(xiàn)較多的全腎小球硬化，硬化指數(shù)(GI)C時(shí)間點(diǎn)分別是B時(shí)間點(diǎn)、A時(shí)間點(diǎn)的1.11、1.28倍。E2組病理改變明顯輕于B組。E1組在B時(shí)間點(diǎn)與B組相比，病理改變有所減輕，GI值比B組減少33％；但在C時(shí)間點(diǎn)與B組相比無(wú)差異。其余各干預(yù)組病理改變與B組大致相同，GI值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3．腎皮質(zhì)TGF-β1

8、、磷酸化NF-кBp65的蛋白表達(dá) A時(shí)間點(diǎn)，B組TGF-β1、NF-кBp65的蛋白表達(dá)比A組升高2.75、6.87倍。B時(shí)間點(diǎn)，E2組 TGF-β1、NF-кBp65蛋白表達(dá)比B組降低43％、60％。C時(shí)間點(diǎn)，E2組TGF-β1、NF-кBp65蛋白表達(dá)比B組降低了53％、56％，所有差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義核因子кB在腎小球硬化中的作用及反義核酸的干預(yù)(P<0.05)。而E1組FGF-β1、NF-кBp65蛋白表達(dá)與B組比較，只

9、在B時(shí)間點(diǎn)有降低，C時(shí)間點(diǎn)無(wú)差異。 4．腎小球Caspase-3、活化NF-кBp65的表達(dá) A時(shí)間點(diǎn)，B組的Caspase-3、NF-кBp65陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)分別是A組的2.86、3.55倍。B時(shí)間點(diǎn)，E2組Caspase-3表達(dá)比B組減少47％，E1組則與B組無(wú)差異；E1、E2組NF-кBp65表達(dá)比B組減少了51％、55％。C時(shí)間點(diǎn)，E2組Caspase-3、NF-кBp65的表達(dá)量與B組相比分別減少了34％、52％

10、；而E1組兩因子的表達(dá)量與B組無(wú)差異。 5．腎小球凋亡指數(shù)的比較 在A時(shí)間點(diǎn)，B組凋亡指數(shù)比A組明顯增多，是A組的12.2倍。B時(shí)間點(diǎn)，E1、E2組凋亡指數(shù)比B組減少27％、61％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C時(shí)間點(diǎn)，E2組凋亡指數(shù)比B組減少41％，而E1組則與B組無(wú)差異。 6．血清IL-6、TNF-α的表達(dá) 在各時(shí)間點(diǎn)，與A組比較，B組IL-6、TNF-α的表達(dá)均明顯升高。E2組IL-6、TNF

11、-α的表達(dá)與B組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而E1組IL-6、TNF-α的表達(dá)與B組比較，只在B時(shí)間點(diǎn)有降低，C時(shí)間點(diǎn)無(wú)差異。 7．直線相關(guān)分析 尿蛋白、GI、TGF-β1、Caspase-3、腎小球凋亡細(xì)胞數(shù)及IL-6、TNF-α的表達(dá)均與NF-кBp65呈正相關(guān)。 結(jié)論：系膜細(xì)胞的增殖與凋亡、炎癥因子 TGF-β1、IL-6、TNF-α的表達(dá)上調(diào)均與硬化有密切關(guān)系。NF-кB的活化參與炎癥