17β-雌二醇的快速舒血管效應及其內皮依賴和非內皮依賴的作用機制.pdf

1、目的 本課題采用Myodap血管張力儀進行體外血管灌流實驗，測量雌性SD大鼠離體胸主動脈環(huán)等長張力，旨在觀察17β-雌二醇(17β-estradiol，E<,2>)的快速舒血管效應并探討其內皮依賴和非內皮依賴性的作用機制。血管張力改變將導致高血壓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生，本研究將為闡明雌激素擴張血管的作用機制提供理論和實驗依據。 本論文主要包括以下兩個部分： 第1章 17β-雌二醇的快速舒血管效應及其

2、內皮依賴性作用機制 第2章 17β-雌二醇快速舒血管效應的非內皮依賴性作用機制 方法 1.離體血管環(huán)的制備和張力測定雌性SD大鼠斷頸處死，迅速分離胸主動脈，放入預冷的Lrebs液，去除血管上的脂肪及結締組織，將動脈剪成2段長2mm的血管環(huán)，置于10ml含Kerbs液的器官小室中。兩根細金屬絲分別由血管內腔穿過血管環(huán)，并固定于Myodap血管張力儀(丹麥，Danish Myo TechnologyA/S)兩端的肌動

3、描記器裝置上，將溫度設定在37℃，持續(xù)充以95﹪O<,2>和5﹪CO<,2>的混合氣體。調整血管環(huán)至適當?shù)那柏摵?通過血管張力儀標準化步驟確定)，平衡60～90min，期間每隔20min更換Kebs液一次。實驗血管先用苯腎上腺素(PE，10<'-6>mol/L)鑒別血管收縮活性，一些實驗血管需去除內皮，采用不繡鋼絲插入血管腔中輕輕滾動完成，用ACh(10<'-5>mol/L)檢測內皮完整性，對ACh舒張大于70﹪認為內皮完整，舒張消失則

4、認為內皮破壞成功。沖洗血管環(huán)再次平衡至基線水平，然后進行實驗。 2.電子顯微鏡內膜完整的主動脈血管環(huán)分別用Krebs(對照)或6mmol/L甲基-β-環(huán)糊精處理60min，4℃固定過夜放在含2﹪戊二醛、2﹪多聚甲醛和蔗糖的0.1mol/L的二甲砷酸鈉鹽溶液中，樣本用0.1mol/L的二甲砷酸鈉鹽溶液沖洗，然后再次固定于4﹪鋨酸中1h，樣本用乙醇脫水、用環(huán)氧樹脂包埋在Epon812，超薄切片用醇制的醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛二重染色，用透射電子

5、顯微鏡觀察內膜結構。 結果 1.E<,2>對預收縮血管的效應及去除內皮的影響內皮完整或去內皮的血管環(huán)，用PE(10<'-6>mol/L)或高鉀(100mmol/L)預收縮，約20～30min達到最大穩(wěn)定狀態(tài)，然后分別加入不同濃度的E<,2>(10<'-9>～1O<'-4>mol/L)。結果顯示，E<,2>濃度為10<'-9>mol/L時，沒有觀察到血管舒張，10<'-8>～10<'-6>mol/L時，E<,2>呈濃度依

6、賴性地舒張血管，約5分鐘起效，40分鐘達到平衡，去內皮的血管環(huán)舒張程度明顯小于內皮完整的血管環(huán)；但在E2濃度增高至10<'-5>～10<'-4>mol/L時，去內皮與內皮完整的血管環(huán)血管舒張程度無差異(內皮完整：(67.18±9.58)﹪，去內皮：(57.99±8.57)﹪；n=10；P>0.05)。 2. L-NAME和MB對E<,2>舒血管作用的影響L-NlAME是一氧化氮合酶(NOS)的抑制劑，MB是鳥苷酸環(huán)化酶(GC)的

7、抑制劑。內皮完整的血管環(huán)用L-NAME(10<'-4>mol/L)或MB(10<'-5>mol/L)孵育20min，然后用PE或高鉀預收縮，穩(wěn)定后分別加入E<,2>(10<'-6>、10<'-5>mol/L)。結果表明，L-NAME或MB可以顯著抑制E<,2>(10<'-6>mol/L)的舒血管效應；但是L-NAME或MB并不抑制E<,2>(10<'-5>mol/L)的舒血管效應；去內皮與內皮完整用L-NAME或MB孵育的血管環(huán)舒張沒有

8、統(tǒng)計學差異。 3．Tramoxifen對E2舒血管效應的影響為了觀察雌激素受體是否參與介導了雌激素快速舒張血管的作用，內皮完整的血管環(huán)，用選擇性雌激素受體調節(jié)劑Tamoxiofen(Ta，他莫昔芬，10<'-5>mol/L)孵育30min，用PE預收縮，加入E<,2>(10<'-6>mol/L)，與對照組不用Tamoxifen孵育比，觀察到E<,2>舒血管效應顯著抑制。 4. 甲基-β-環(huán)糊精對質膜微囊結構的影響用透

9、射電子顯微鏡觀察甲基-β-環(huán)糊精對主動脈內膜質膜微囊結構的影響。與對照組用Krebs液孵育比較，內膜完整的血管環(huán)，甲基-β-環(huán)糊精處理(Mβ CD，6mmol/L，60min)后，質膜微囊結構顯著被破壞。 5. 甲基-β-環(huán)糊精對E<,2>舒張血管效應的影響內膜完整的血管環(huán)，用甲基-β-環(huán)糊精(M β CD，6mmol/L)預處理60min后，用高鉀預收縮，穩(wěn)定后加入不同濃度E<,2>(10<'-8>～10<'-5>mol/L

10、)。結果表明，與對照組不用MβCD處理相比，E<,2>(10<'-8>～10<'-6>mol/L)誘導的血管舒張效應顯著被抑制，但是高濃度的E<,2>(10<'-5>．mol/L)誘導的血管舒張效應不被抑制。 6.E<,2>對CaCl<,2>發(fā)縮量效曲線的影響為研究高濃度E<,2>是否主要通過抑制細胞外鈣內流而直接舒張血管平滑肌，在去內皮的血管環(huán)，測量E<,2>對CaCl<,2>在無鈣高鉀溶液中收縮的影響。去內皮的血管環(huán)，用無

11、鈣Krebs溶液沖洗三次(間隔10min)，穩(wěn)定后，換用無鈣高鉀溶液(含1mmol/LEGTA，60mmol/LK<'+>)，無/有E<,2>(10<'-5>、10<'-4>mol/L)孵育30min，累積加入CaCl<,2>(5×10<'-4>、10<'-5>、5×10<'-5>、10<'-2>mol/L)。結果顯示，在無鈣高鉀溶液中，CaCl<,2>誘導濃度依賴性血管收縮，E<,2>(10<'-5>、10<'-4>mol/L)孵育可

12、抑制CaCl<,2>誘導的血管收縮，使CaCl<,2>收縮量效曲線右移。 結論 1.雌激素具有快速舒血管效應，既有內皮依賴性作用機制，也有非內皮依賴性作用機制，與雌激素作用的濃度有關。 2.雌激素濃度為10<'-9>mol/L時，沒有觀察到血管舒張效應，濃度為10<'-8>～10<'-6>mol/L時，雌激素能濃度依賴性的快速舒張血管，作用呈內皮依賴性，與雌激素受體介導內皮釋放NO有關，且需要內膜質膜微囊結構完整