高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形差異表達基因的篩選、鑒定及功能研究.pdf

1、神經(jīng)管形成是胚胎早期發(fā)育中的重要事件，是指從神經(jīng)板出現(xiàn)、卷折形成神經(jīng)褶到左右神經(jīng)褶在背側(cè)中線靠攏愈合形成神經(jīng)管的連續(xù)生物學過程。神經(jīng)管是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的原基，神經(jīng)管的發(fā)生和分化是腦和脊髓正常發(fā)育的前提。在神經(jīng)管發(fā)育過程中，多種環(huán)境致畸因素可對其產(chǎn)生影響，引發(fā)神經(jīng)管畸形(neuraltube defects，NTDs)。神經(jīng)管畸形是發(fā)生率最高、危害也最為嚴重的一類先天畸形，不僅危及患兒的生命和健康，而且給社會和家庭造成沉重的經(jīng)濟負擔。

2、 從上個世紀開始，科學家開始檢測誘發(fā)神經(jīng)管畸形的各種致畸因子，其中高溫是較常見且難以預防和避免的一種環(huán)境致畸因素。因此，探討高溫致神經(jīng)管畸形的發(fā)生機理成為實驗畸形學中的一個研究熱點。近年來，人們從細胞、亞細胞和分子水平對高溫致神經(jīng)管畸形的機理進行了大量的動物實驗和細胞培養(yǎng)研究，觀察了高溫對細胞增殖、凋亡、分化、粘著、類聚、組織誘導和器官發(fā)生等方面的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)管形成和分化過程中，某一或某些相關基因的特異表達或特異不表達、

3、上調(diào)表達或下調(diào)表達都會導致神經(jīng)管發(fā)育異常，引發(fā)神經(jīng)管畸形。高溫致神經(jīng)管畸形的發(fā)生是一個多基因參與的復雜過程，這其中有些基因上調(diào)表達，有些基因下調(diào)表達，而關于這些差異表達基因的系統(tǒng)研究至今仍未見報道 抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)是一種尋找差異表達基因的技術，可以克隆出與驅(qū)動子相比在檢測子中特異表達和上調(diào)表達的基因。應用抑制性消減雜交方法構建的消減cDNA文庫具

4、有特異性和均等化兩大突 出優(yōu)點。在本項實驗中，我們應用抑制性消減雜交技術構建了高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形的雙向消減cDNA文庫，從中篩選到了高溫致神經(jīng)管畸形過程中上調(diào)表達和下調(diào)表達的基因。通過序列測定和同源性比較對這些差異表達基因進行了分析，然后通過Northern雜交方法進一步證實這些基因在高溫致神經(jīng)管畸形過程中的差異表達情況。隨后從這些差異表達基因中，挑選在胚胎發(fā)育中起重要作用的下調(diào)表達基因——Npml，對其功能進行了體外研究

5、。 第一部分高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫的構建及鑒定 為篩選高溫致神經(jīng)管畸形過程中的差異表達基因，我們首先構建了高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫。實驗中，我們分別提取高溫組和對照組金黃地鼠胚胎神經(jīng)管組織總RNA，通過SMART<'Tm>cDNA合成的方法反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA(ds eDNA)。將酚氯仿純化后的ds cDNA用RsaI消化，消化后的dscDNA再次經(jīng)酚氯仿純化，并用雙蒸水調(diào)

6、整濃度至300 ng/μl。取純化后的ds cDNA用于抑制性消減雜交。按PCR-select<'TM> cDNA subtraction kit說明進行正反兩個方向的消減雜交。以高溫組ds cDNA做檢測子、對照組ds cDNA做驅(qū)動子進行消減雜交，構建高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形正向消減cDNA文庫，可從中篩選高溫致神經(jīng)管畸形過程中上調(diào)表達的基因。反之，以對照組ds cDNA做檢測子、高溫組ds cDNA做驅(qū)動子進行消減雜交，構建高溫致

7、金黃地鼠神經(jīng)管畸形反向消減cDNA文庫，可從中篩選高溫致神經(jīng)管畸形過程中下調(diào)表達的基因。將看家基因Gapdh設立為消減雜交實驗的對照以檢測消減效率。結果，Gapdh的表達豐度在消減雜交結束后明顯降低，表明我們的消減效率很高。將消減雜交得到的產(chǎn)物純化，然后通過T-A克隆的方法將其與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，鋪含氨芐青霉素的LB/X-gal/IPTG平板，構建消減cDNA文庫。經(jīng)藍白斑初步篩選后，再利用菌落PCR方法進一步鑒定

8、。結果顯示，構建的消減cDNA文庫中包含150 bp-1 kb的長短不一的差異表達基因片段。這說明我們構建的高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫是成功的，可用于篩選差異表達基因。 第二部分高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形差異表達基因的篩選、序列分析及鑒定 由于消減cDNA文庫中包含的基因信息較多，一般采用隨機法挑選文庫中的克隆進行測序。本實驗中，我們選取經(jīng)菌落PCR證實插入片段較長的克隆進行測序，并將測序結果通過blas

9、tn軟件與Genbank數(shù)據(jù)庫中的已知基因進行序列比對和同源性分析。在高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形反向消減cDNA文庫中，我們共篩選到14個下調(diào)表達基因，經(jīng)分析均與已知基因有較高的同源性。這些基因編碼的蛋白有核糖體蛋白，參與代謝的酶，翻譯及轉(zhuǎn)錄因子和其他。隨后通過Northern雜交證實了這些基因在高溫致畸胚胎神經(jīng)管中表達水平均明顯降低。而在高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形正向消減eDNA文庫中，由于擴增得到的片段普遍較短，測序和同源性分析后僅發(fā)現(xiàn)

10、了一個有意義的差異表達基因片段。此片段與小鼠磷酸甘油酸酯激酶(Pgkl)同源且同源性高達92﹪。Northern雜交證實該基因在高溫致畸胚胎神經(jīng)管中表達水平明顯升高。從高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫中篩選得到的基因，它們的差異表達情況均得到Northern雜交驗證，證實這些基因在高溫致神經(jīng)管畸形過程中的表達發(fā)生了異常變化，同時也說明這些基因的差異表達與高溫致神經(jīng)管畸形的發(fā)生密切相關。 第三部分Npml基因功能的體外

11、研究 Npml(nucleophosmin)是我們從高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形反向消減eDNA文庫中篩選到的一個基因。以往的研究顯示，Npml在胚胎發(fā)育過程中扮演著重要的角色。Npml<'-/->的小鼠胚胎較正常胚胎發(fā)育遲緩，前腦發(fā)育缺陷，眼睛缺失。說明Npml對神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育是必需的。因此我們對Npml在高溫致畸中的作用機制進行了研究。由于在高溫致神經(jīng)管畸形過程中Npml基因呈下調(diào)表達，我們在神經(jīng)干細胞(neural s

12、tem cells，NSCs)的體外培養(yǎng)中，應用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術，對該基因的功能進行了比較深入的研究。實驗結果顯示，RNAi技術成功地在mRNA和蛋白水平上降低了Npml的表達，干擾效果得到了RT-PCR和Western blot證實。隨后我們從細胞增殖、凋亡和分化三個方面著手，研究Npml基因表達降低對神經(jīng)干細胞的影響。結果表明，Npml基因表達降低后，神經(jīng)干細胞的增殖速度明顯減慢，凋亡的發(fā)生

13、率明顯增加，而神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞方向分化的比例未受到影響。此外，Npml基因表達降低后，p53蛋白表達升高，說明Npml基因干擾后引發(fā)的神經(jīng)干細胞凋亡與p53信號通路密切相關。 本項研究成功地構建了高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫，并從中篩選到了與高溫致神經(jīng)管畸形密切相關的下調(diào)表達基因和上調(diào)表達基因；還以體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞為研究模型，用RNAi技術，對在胚胎發(fā)育中起重要作用的下調(diào)表達基因Npm1在高溫