黃海海泥和廬山土壤樣品中放線菌的分離、活性及生物多樣性研究.pdf

1、放線菌是一類高GC含量的革蘭氏陽性菌，它在自然界分布廣泛，在醫(yī)藥工業(yè)上具有重大的應(yīng)用價(jià)值，為人類公共健康做出重大貢獻(xiàn)。本研究首先采用傳統(tǒng)分離方法分別從海泥和廬山樣品中分離得到235株和197株放線菌，經(jīng)過形態(tài)重排，從海泥樣品中選出133株和廬山樣品中選出52株形態(tài)不同的菌株。通過進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定，海泥中的133株放線菌分別屬于4個(gè)不同的屬，而廬山樣品的52株分別屬于8個(gè)不同的屬。對(duì)這185株放線菌進(jìn)行培養(yǎng)，取發(fā)酵液分別對(duì)大腸桿菌、

2、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母進(jìn)行生物活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有18.4％的菌株對(duì)大腸桿菌有抑菌活性，8.1%的菌株對(duì)枯草芽孢桿菌有抑菌活性，僅有2.1%的菌株對(duì)釀酒酵母有抑菌活性。
　　其次，本實(shí)驗(yàn)使用新的分離技術(shù)擴(kuò)散室法對(duì)樣品進(jìn)行分離。目前傳統(tǒng)分離方法只能分離到0.1%-1%的微生物，尚有99%的微生物難培養(yǎng)。造成這種結(jié)果的重要原因是傳統(tǒng)分離方法無法完全模仿自然界中微生物的生長(zhǎng)環(huán)境。相比傳統(tǒng)的平板分離法，采用擴(kuò)散室法能較好地模擬自然界環(huán)境，可分

3、離更多樣的微生物。本研究通過膜材質(zhì)，瓊脂濃度，觀察方式等實(shí)驗(yàn)確定擴(kuò)散室法分離的較優(yōu)條件。采用此條件對(duì)樣品進(jìn)行分離，成功分離得到放線菌。結(jié)果表明擴(kuò)散室法可以有效分離得到放線菌，為后續(xù)分離更多樣的放線菌奠定基礎(chǔ)。
　　為進(jìn)一步考察海泥和廬山樣品的放線菌多樣性，采用原位分析法對(duì)其進(jìn)行研究，即先分別提取2個(gè)樣品中的總DNA（宏基因組），然后用特異性引物直接PCR擴(kuò)增放線菌的序列。以Identity≥99%作為同一基因類型的標(biāo)準(zhǔn)。從海泥中挑

4、取27個(gè)克隆，檢測(cè)到4種類型，包括通過傳統(tǒng)分離法分離得到的Actionbacteria，其余種類如Gemmatimonadetes、Nitrospina、planctomycete和一些未培養(yǎng)的細(xì)菌，通過原位分析法才發(fā)現(xiàn)。從廬山土壤中挑取31個(gè)克隆，檢測(cè)到10種類型，包括傳統(tǒng)分離得到的Actionbacteria以及 Thermomonosporaceae bacterium、Acidimicrobiaceae、Aciditerrimo

5、nas和一些未培養(yǎng)的細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用原位分析法可發(fā)現(xiàn)微生物的種類更為豐富，但并不能包含傳統(tǒng)分離法所分離的所有類群，因此，將上述兩種方法相結(jié)合將更為客觀全面的反映樣品中放線菌多樣性。
　　最后，采用抗性篩選和基因探礦技術(shù)，對(duì)海泥和廬山樣品使用萬古霉素為抗性篩選標(biāo)記進(jìn)行菌株篩選；通過萬古霉素篩選出來的菌株共有35株，其中31株來源于廬山土壤樣品。以糖肽類化合物合成途徑中的關(guān)鍵基因（vanHAX, oxyB, hall, oxy